需自备试剂：
1×PBS，使用0.22 um 滤膜过滤后再使用或者采购已过膜的PBS（使用前需平衡到室温）。

一、样本预处理：
细胞上清：
（1）收集细胞上清 10-50 mL（收集时细胞培养密度不低于 1×10 6 cfu/mL）；
（2）细胞上清离心（3000 g，10 min），保留上清；
（3）上清液使用 0.22 um 滤膜过滤；
（4）过滤后用 100 kDa 超滤管进行浓缩，浓缩体积比为 1 : 20，收集浓缩液备用。
尿液：
（1）采集中段晨尿约 10-50 mL，离心（3000 g，10 min），保留上清；
（2）上清液使用 0.22 um 滤膜过滤；
（3）过滤后用 100 kDa 超滤管浓缩，浓缩体积比为 1：20，收集浓缩液备用。
二、外泌体分离：
1、试剂准备：
保存液 (5×)和清洗液 (5×) 均需要用去离子水稀释到 1×，所用试剂需用 0.22 um 滤膜过滤后再使用。
2、柱平衡：
（1）从冰箱取出 SEC 纯化柱，将其垂直固定（需自备固定装置）；
（2）置于室温下放置 30 min；
（3）SEC 纯化柱下方放置一个空烧杯；
（4）打开顶部柱塞和底盖，将管中保存液排空至底部出口无液体流出，向柱中加入15mL PBS，可分次加，让液体全部流出，再上样。
3、样品上样：
（1）取 8 个 EP 管，依次标记为 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8；
（2）将 1 mL 样品从 SEC 纯化柱顶部沿壁加入，样品wan全进入填料并且底部出口无液体流出后，加入 0.5 mL 1×PBS，使用 EP 管 1 收集流出液，收集体积为 0.5 mL；
（3）待上一个 0.5 mL 平衡液全部进入排阻柱内后，再添加 0.5 mL 的PBS，使用 EP 管 2 收集流出液，收集体积为 0.5 mL；
注意：使用时应尽量保证柱内有液体，以确保填料能够被充分润湿。
（4）重复（3）操作 6 次，总共收集 8 管洗脱液。
注意：样品最小体积不应小于 1 mL；样品不足 1 mL 时，用 1×PBS稀释到 1 mL，混匀后再上样。
4、外泌体收集：
（1）若想获得高回收率外泌体: 只保留3， 4，5，6，7的馏分，共计 2.5 mL；若不区分馏分，在第 2个 0.5 mL 1×PBS全部进入排阻柱内后，直接加入 2.5mL PBS，洗脱至一个收集管中。
（2）若想获得高纯度外泌体: 将第4， 5，6的馏分合并，共计 1.5 mL。
注意： 如需浓缩外泌体洗脱液，可使用 100 kDa 超滤管，4000 g 离心浓缩到目的体积即可。
5、SEC 纯化柱的清洗与储存：
收集结束后，加10 mL 清洗液，接着用1×PBS 冲洗15 mL，再用1×保存液冲洗10 mL。将底盖关闭，用1×保存液填满SEC 纯化柱，用柱塞封闭顶部端口并检查无液体流出后，4 ℃保存。
注意：1. 该 SEC 纯化柱可重复使用 10 次。 2. 使用结束后需要用封口膜将柱上端封死，避免保存液挥发。