5mg/mL

一、细胞培养器皿的表面包被：
组织培养器皿的表面包被推荐浓度为1-5μg/cm2，起始浓度可shou选5μg/cm2。建议根据具体细胞类型来优化。
1、6mM HAc 稀释液的制备
本品以溶于6mM HAc（=0.36g/L HAc）的无菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建议用6mM HAc 溶液做进一步稀释。
配制方法：取34.5μL 冰醋酸（17.4 M）加入100ml 双蒸水，充分混匀后即得到6mM HAc 溶液，0.22μm 滤膜过滤除菌后待用。
2、包被步骤
（1）根据自身实验体系以及优化后的包被浓度来计算所需的胶原蛋白量，并加入相应孔内，确保胶原蛋白溶液wan全覆盖表面。
①以包被浓度为5μg/cm2，先用6mM HAc 稀释液将胶原蛋白（5mg/mL）稀释到合适的中间浓度，50μg/mL，然后参考表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表 来加量到各孔内；
②以包被浓度为2μg/cm2，先用6mM HAc 稀释液将胶原蛋白（5mg/mL）稀释到合适的中间浓度，12μg/mL，然后参考表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内；
                                                   表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表
（2）室温孵育1h，小心吸掉多余液体，用无菌PBS 清洗3~4 次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3 个月。
二、三维胶原的制备：
当鼠尾胶原蛋白I 使用浓度>1mg/mL，pH 7.0 左右皆可形成具有一定强度的三维胶，建议成胶浓度为1-2mg/mL。
由于本品是以溶于6mM HAc 的无菌溶液形式提供，在成胶过程需先加入0.06 倍体积的0.1M NaOH 中和。
1、需要溶液准备（无菌、预冷）
10×PBS（可含酚红）或10×细胞培养液
0.1M NaOH
双蒸水
2、三维胶原制备（不含细胞）（以配制1mL，1mg/mL 三维胶为例）：
（1）取200μL 胶原蛋白（5mg/mL）加到置于冰浴的离心管内，加入690μL 无菌水。之后加到12μL 0.1M NaOH【注意：该步骤不能反，如果反过来把12μL 0.1M NaOH 加到胶原溶液中，会由于NaOH 不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入100μL 10×PBS 或10×细胞培养液，混匀后立即加到培养器皿中【注意：混匀后pH 为7.0 左右，如果PBS 或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH 试纸测试】
（2）将培养器皿在室温（25℃左右）放置20min 待胶凝固后，转移到培养箱内。【注意】：如果配制中使用的是10×PBS，需要在做细胞培养前，先加入适当体积的细胞培养液预平衡。
3、三维胶原制备（含细胞）（以配制1mL，1mg/mL 三维胶为例）：
（1）准备好细胞悬液，并放置于冰浴中。
（2）将200μL 胶原蛋白（5mg/mL）加到12μL 0.1M NaOH【注意：该步骤不能反，如果反过来把12μL0.1M NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH 不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入23μL 10×PBS
或者10×细胞培养液，立即混匀【注意：混匀后pH 为7.0 左右，如果PBS 或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试】。再加入760μL 的细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。
（3）将培养器皿在室温（25℃左右）放置20min 待胶凝固后，加入适当体积细胞培养液，转移到培养箱中培养。

2-8℃保存，不可冻存，有效期12个月。

1、整个操作请于冰上进行，因室温鼠尾胶原I 可迅速成胶，操作过程尽量保持低温。
2、整个操作请在无菌环境下无菌操作，避免污染以影响细胞生长。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

溶液