一、样品均浆
1、确定样品的种类，在室温下，根据下表进行均浆。样品的体积不能超过 TriiZol 的 10%。必须确保使用足够量的 TriiZol，因为不足量的 TriiZol，会导致 DNA 污染 RNA。
2、（可选择）当含大量脂肪、蛋白、多糖或细胞外基质（例如，肌肉、脂肪或植物的块胶组织）的样品制备 RNA 时，需增加离心步骤，从样品中去除不溶解的物质。 
注意：如果进行 DNA 分离，不要离心。

二、相分离
1、在室温下，将均浆液孵育 5min，允许核蛋白复合体分离； 
2、在每 1mL TriiZol 制备的均浆液中加入 0.1mLBCP（或0.2mL 氯仿）。盖紧盖子； 
3、剧烈震荡试管 15sec； 
4、在室温下孵育 2~3min； 
5、在 4℃下，12,000g 离心 15min； 
注意：裂解液分为红色的苯fen-BCP（或氯仿层），中间层，无色的水相。RNA 保留于水相中。上层的水相大约为总体积的 50%； 
6、将试管倾斜 45°，小心吸出上层溶液，不要扰动中间层及苯层； 
7、将上层溶液转移至新的试管中； 

三、RNA沉淀
使用恰当预防措施避免 RNase 污染。 
1、（可选择）当从小量样品（＜106 细胞或＜10mg 组织）中沉淀 RNA 时，应在水相中加入 5~10μg无 RNase 酶的糖原（glycogen）； 
注意：糖原（glycogen）与 RNA 共沉淀，当其浓度≤4mg/mL 时，不抑制第一链的合成，不抑制PCR 反应。 
2、在每 1mL TriiZol 均浆后，所得到的水相中加入 0.5mL 异丙醇； 
3、在室温下孵育 10min； 
4、在 4℃下，12,000g 离心 10min； 
注意：在离心前，RNA 是不可见的，离心后，在试管底部及侧壁形成胶样沉淀。 

四、RNA 洗涤 
1、从试管中取出上清液，只剩下 RNA 沉淀； 
2、用 1mL 75%乙醇洗涤沉淀（起始为 1mL TriiZol 所得到的沉淀）； 
3、短暂涡旋，然后在 4℃下，7500g 离心 5min，其上清； 
4、在空气中干燥 RNA 沉淀 5~10min。不要真空离心干燥沉淀。 
注意：不要让 RNA 沉淀干燥，因为会降低 RNA 溶解度。导致 RNA 的 A260/A280＜1.6。 

五、RNA 重悬 
1、用于溶解 RNA 的试管及溶液必须是无 RNase 酶的。用DEPC水重悬 RNA 沉淀，不要使 RNA 干燥，用吸头反复吹打。如果溶解于DEPC 水，在室温下，涡旋RNA 沉淀5~10min，也可在 50~55℃下孵育 10~15min。用100ulDEPC水溶解100-400ugRNA样品。反复吹打使RNA溶解，在 50~55℃下孵育 10~15min。 
2、溶解的 RNA，应保存于-70℃；

室温保存，有效期12个月。

1、如果需要测量 RNA 的 A260/A280 的比值，建议使用 RNA 定量缓冲液对样品稀释后，进行测量。
2、所有离心管，枪头及相关溶液都必须无 RNA 酶污染。耐高温器物可 180℃烘烤 4 小时以去除RNA 酶，其它器物去除 RNA 酶可考虑用 0.01%的 DEPC 水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用 DEPC 水配制。加 0.01% DEPC 至重蒸水或 MiliQ 级水中，处理过夜，灭菌即成 DEPC 水。
3、使用冻存的细胞或组织抽提总 RNA 的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的 RNase 会被释放出来并剪切样品。如果不能及时抽 RNA， 推荐先加入适量 TriiZol，并裂解样品后冻存。
4、必须戴一次性手套操作，且尽量不要对着 RNA 样品呼气或说话，以防 RNA 酶污染。建议戴一次性口罩操作。
5、TriiZol 含有毒物质，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触 TriiZol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。
6、为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等。

配有无毒分相试剂，无需使用氯仿