- 牛痘病毒加帽酶
- 牛痘病毒加帽酶
产品描述 描述 牛痘病毒加帽mei，来源于携带牛痘病毒 MR的重组大肠杆菌菌株，由 D1R 和 D12L 两个亚基组成，兼具三种酶活性（RNA 三磷酸酶活性、鸟苷酸转移酶活性和niao嘌呤甲基转移酶活性）。牛痘病毒加帽mei是催化形成帽子结构的有效酶，能特异性地将 7-甲基鸟苷酸帽子结构(m7Gppp，Cap 0) 加至 RNA 的 5'端。帽子结构(Cap 0)对真核生物 mRNA 的稳定、转运和翻译有着重要的作用。通过酶促反应给RNA 加帽是一种有效简单的方法，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的 RNA 的稳定性和翻译能力。
产品组分：组分 不同规格各组分体积 500U 2000U 10000U 牛痘病毒加帽mei（10 U/μL） 50 μL 200 μL 1 mL 10×加帽缓冲剂 100 μL 400 μL 2×1 mL
储存缓冲液：
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50% glycerol.
活性定义：
在 37℃条件下，1 h 内将 10 pmol GTP wan全掺入到 80 nt 转录产物所需的酶量定义为 1 个活性单位(U)。来源 携带牛痘病毒MR的重组大肠杆菌应用 1、体内或体外翻译前 mRNA 的加帽； 2、mRNA 的 5'末端标记。纯度 ≥90%使用方法 反应体系和条件：
1、加帽反应（反应体系 20 μL）
本实验步骤适用于 10μg RNA（≥ 100 nt）的加帽反应，可根据实验需要放大：
（1）取 10 μg RNA 至 1.5 mL 离心管中，使用无核酸酶水稀释至 15 μL；
（2）65℃加热 5 min，然后取出冰浴 5 min 完成变性；
（3）根据下表配制加帽体系组分 使用量 变性RNA（≤10 μg，长度≥100 nt） 15 μL 10×加帽缓冲剂* 2 μL GTP （10 mM） 1 μL SAM （2 mM） 1 μL 牛痘病毒加帽酶（10 U/μL） 1 μL
*10×加帽缓冲剂：0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
（4）37℃孵育 30 min, RNA 加帽完成，可进行后续实验。
2、5'末端标记反应（反应体系 20 μL）
本实验步骤适用于 5'末端带有三磷酸的RNA 标记，且可根据实验需要放大，其标记效率受反应体系中 RNA 与 GTP 摩尔浓度比以及 RNA 样本中 GTP 含量的影响：
（1）取适量的 RNA 至 1.5 mL 离心管中，使用无核酸酶水稀释至 14 μL；
（2）65℃加热 5 min，然后取出冰浴 5 min，完成变性；
（3）根据下表配制 5'末端标记反应体系：组分 使用量 变性RNA 14 μL 10×加帽缓冲剂 2 μL GTP mix ** 2 μL SAM （2 mM） 1 μL 牛痘病毒加帽酶（10 U/μL） 1 μL ** GTP mix 为 GTP 和少量标记物，其中GTP 使用浓度参照注意事项 3。
（4）37℃孵育 30 min, RNA 5'末端标记完成，可进行后续实验。储存/保存方法 -20℃以下保存，避免反复冻融或频繁暴露于温度变化中，shou次使用时建议进行分装。
技术指标 质量控制：
核酸外切酶活性：10 U的本品和1 μg λ-Hind III digest DNA 在 37℃下反应 16 小时，DNA的电泳谱带不发生变化；
核酸内切酶活性：10 U 的本品和 1 μg λDNA在 37℃下反应 16 小时，DNA 的电泳谱带不发生变化；
切口酶活性：10 U 的本品和 1 μg pBR322 在 37℃下反应 16 小时，DNA 的电泳谱带不发生变化；
RNase活性：10 U的本品和1.6 μg MS2 RNA 在 37℃下反应 4 小时，RNA 的电泳谱带不发生变化；
大肠杆菌 DNA 残留检测：10 U 本品中残留的核酸经 E.coli 16s rDNA 特异性的 TaqMan qPCR 检测，E.coli 基因组残留≤1 拷贝；
细菌内毒素（Endotoxin）：LAL-Test，中国药典 2020 版第四部凝胶限度试验法 通则（1143），细菌内毒素含量≤10 EU/mg。注意事项 1、反应前热处理 RNA，去除转录产物 5'末端的二级结构，若已知 RNA 5'末端的结构复杂，可以延长反应时间至 60 min，以提高加帽效率；
2、用于加帽反应的 RNA 在使用之前应进行纯化并溶解于无核酸酶水。溶液中不能含有EDTA 和盐；
3、5'末端标记反应体系中， GTP 储液应稀释为反应体系中 mRNA 摩尔浓度的 1-3 倍；
4、反应体系体积可根据实际需求按比例进行放大或缩小。参考文献 参考文献 [1] Mao X, Shuman S. Intrinsic RNA (guanine-7) methyltransferase activity of the vaccinia virus capping enzyme D1 subunit is stimulated by the D12 subunit. Identification of amino acid residues in the D1 protein required for subunit association and methyl group transfer. J Biol Chem. 1994;269(39):24472-24479. PMID: 7929111
[2] Grudzien E, Stepinski J, Jankowska-Anyszka M, Stolarski R, Darzynkiewicz E, Rhoads RE. Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translational efficiency. RNA. 2004;10(9):1479-1487. PMID: 15317978
[3] Ramanathan A, Robb GB, Chan SH. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res. 2016;44(16):7511-7526. PMID: 27317694研究领域 研究领域 Drug DiscoverymRNA Drug/Vaccine温馨提示：本产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究