- Human PD-L1/B7-H1 ELISA Kit
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Human PD-L1/B7-H1 ELISA Kit
产品描述 储存/保存方法 未开封试剂盒，2-8°C储存。概述 检验原理 本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人PD-L1/B7-H1抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物su化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的PD-L1/B7-H1与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在 450 nm 波长(参考校正波长 540nm 或570nm) 测定吸光度值。产品组成 注：试剂盒中的终止液是酸性溶液，使用时请做好眼镜、手、面部及衣服的防护。组成
描述
规格
拆封后，稀释或重溶的试剂有效期
Human PD-L1/B7-H1 Microplate
已包被抗体的96孔聚苯乙烯
1块
将未使用的板条放回带有干燥剂的铝箔袋中密封后，置于2-8℃储存，30天
Human PD-L1/B7-H1 标准品
Human PD-L1/B7-H1 标准品（冻干）
2支
溶解后，计算用量分装，可在-20℃储存14天
Human PD-L1/B7-H1 检测抗体
Human PD-L1/B7-H1
检测抗体
1支
短期存储(14天)，建议置于2-8℃；长期存储，建议置于-20℃
40×SA-HRP
链霉亲和素-HRP（40×）
1支
40倍浓度于2-8℃保存；1倍工作浓度不建议保存
1×稀释用缓冲液
稀释用缓冲液（1×），50mL
1瓶
开封后，2-8℃储存，30天
显色液
TMB底物
1瓶
终止液
6mL 强酸，用于破坏HRP酶结构
1瓶
10×浓缩洗涤缓冲液
浓缩洗液，50mL/瓶
1瓶
封板膜
96孔板封板膜
3张
常温存放，为避免污染，不可重复使用
反应种属 Human检测范围 0.15ng/mL-10ng/mL灵敏度 小于11.5pg/mL使用方法 一、实验所需自备试验器材
1、酶标仪（可测量 450nm 检测波长的吸收值及 540nm 或 570nm 校正波长的吸收值）
2、高精度加液器及一次性吸头
3、蒸馏水或去离子水
4、洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5、500mL 量筒
二、实验前准备
（1）样品收集及储存
细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置 30 分钟。离心 15 分钟，
转速为 1000 g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
血浆：使用 EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后 30 分钟内离心15 分钟，转速为 1000 g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
（2）检测前准备工作
使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测
1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取20ml浓缩洗涤液+180mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
1×稀释用缓冲液：试剂盒中的稀释用缓冲液为1×工作液，可直接使用，无需再稀释。
检测抗体：试剂盒中的检测抗体为100×母液，使用前需用1×稀释用缓冲液，稀释到1×工作液。按照每孔用量100μL计算所需体积。例：使用了10个孔，则取10μL的100倍工作浓度的检测抗体，使用稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
SA-HRP： SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100µL。例：使用了10个孔，则取25μL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1ml的1×工作浓度的检测抗体。
显色剂：按每孔100µL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色剂，避光；取出的显色剂仅供当日使用。
标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液（1×）重溶，重溶体积500µL，得到浓度为10000pg/mL 标准品母液。轻轻震摇至少 5 分钟，其充分溶解。每个稀释管中加入 250 μL 稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释， 每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最gao点(10000pg/mL)，稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0 pg/mL）。1、白板（显色完成后，无颜色出现）
三、实验操作步骤
1、准备好所有需要的试剂和标准品；
2、从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3、向微孔板中加入300µL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4、分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔 100µL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育 2 小时;
5、将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液 300µL， 然后将板内洗涤液吸去。重复操作 3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最hou一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6、在每个微孔内加入 100µL 检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育 2 小时；
7、重复第 5步洗板操作；
8、在每个微孔内加入 100µL SA-HRP，室温孵育 20 分钟。注意避光；
9、重复第 5 步洗板操作；
10、在每个微孔内加入 100 µL 显色液，室温孵育 5-30 分钟，注意避光；
11、在每个微孔内加入 50 μL 终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12、加入终止液后 30 分钟内，使用酶标仪测量 450nm 的吸光度值，设定 540nm 或570nm 作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13、计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品 OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应 OD 值对数生成曲线，并通过回归分析确定最jia拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。
四、试剂盒参数
1、回收率
在细胞培养基样本中掺入不同水平的人 PD-L1/B7-H1，测定其回收率。回收率范围在82 -93%，平均回收率在87%。
在人血清样本中掺入不同水平的人 PD-L1/B7-H1，测定其回收率。回收率范围在114.2-119.4%，平均回收率在 117.0%。
2、灵敏度
人PD-L1/B7-H1 的最di可测剂量（MDD）一般小于 11.5pg/mL。
最di可测值是根据 20 个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3、校正
此 ELISA 试剂盒经 NS0 表达的高纯度重组人PD-L1/B7-H1蛋白所校正。
4、线性
样本为经10μg/mL PHA刺激5天的人PBMC细胞；经测定，刺激后人PBMC上清液中PD-L1平均浓度为3600pg/mL。
5、特异性
此 ELISA 法可检测天然及重组人PD-L1/B7-H1蛋白。 将以下因子用稀释剂（1×） 配制成 100 ng/mL 的浓度来检测与人PD-L1/B7-H1的交叉反应。 将 100 ng/mL 的干扰因子掺入中间范围的重组人PD-L1/B7-H1对照品中，来检测对人PD-L1/B7-H1 的干扰。没有观察到明显的交叉反应或干扰。重组人 PD-1/Fc Chimera 没有交叉反应，但当浓度> 50 ng / mL 时有干扰。重组人蛋白
重组小鼠蛋白
B7-1/Fc Chimera
mouse B7-H1 /Fc Chimera
B7-2/ Fc Chimera
Rat B7-1/ Fc Chimera
B7-H2/ Fc Chimera
B7-H3
B7-H4
B7-H6 Fc Chimera
五、常见问题解析2、花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）序号 可能原因 解决方案 1 试剂盒储存不当；不同试剂盒试剂混用 购买新试剂盒，注意储存条件；不可混用 2 赋予温度低，时间短 如果温度偏低，则延长孵育时间和显色时间 3 错加、漏加试剂 严格按照说明书步骤添加正确试剂 4 用于配置溶液的容器不干净，或水有问题 使用干净容器以及合格的蒸馏水 5 洗板过程中浸泡时间长，洗板次数太多，洗板冲击力大 严格按照说明书操作 6 试剂温度不均一 所有试剂要室温平衡30分钟 7 检测抗体和/或HRP浓度太低 参照说明书，不可随意稀释 序号 可能原因 解决方案 1 洗涤次数少，不充分 按照说明书要求洗涤 2 底物3,3',5,5'-四甲基联ben胺（TMB）被金属离子或氧化剂污染或曝光 配制时使用干净容器以及合格的蒸馏水；避光保存 3 孵育温度高和/或时间过长 控制孵育和最后酶促反应的温度和时间 4 加样时未更换枪头，造成交叉污染 每个样都更换枪头 5 附近孔交叉污染 垂直拍板，使用合适的拍板纸，避免孔内进入纸屑 6 样本存在内源性干扰物质 推测可能的感染物质，并进行对应处理 7 样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染、采血guan中添加物影响 避免溶血、污染、过久储存等现象
六、实验流程图
背景说明 程序性死亡因子配体 1(PD-L1)，也被称为 B7- H1 和 CD274，是一种大约 65 kDa 的跨膜糖蛋白， 属于 B7 家族的免疫调节分子。 PD-L1 表达于被炎症激活的免疫细胞，包括巨噬细胞、T 细胞和 B 细胞，角质形成细胞，内皮细胞和肠道上皮细胞，以及各种癌细胞和黑色素瘤。PD-L1 能与 PD-1 和 T 细胞 B7-1/CD80 结合，抑制 T 细胞的活化和增殖，诱导活化的T 细胞凋亡。它通过促进 T 细胞失活和调节 T 细胞发育，在免疫耐受过程中发挥作用。PD- L1 有利于抗炎过程中的 IL-10 和 IL-22 生成树突状细胞的发育，抑制 Th17 细胞的发育。在癌症中，PD-L1 能够抵抗 T 细胞介导的裂解，增强上皮细胞向间质转化的能力，增强Th22 细胞的致瘤功能。在癌症患者的血浆和胶质瘤患者的脑脊液中，其可溶性 PD-L1 会有所升高。它可以被成熟的树突状细胞释放，并保留结合 PD-1 和诱导 T 细胞凋亡的能力。种属 Human性能 注意事项 1、仅供科研使用，不可用于体外诊断；
2、请在试剂盒有效期内使用；
3、不同试剂盒及不同批号试剂盒的组分不能混用；
4、样本值若大于标准曲线的最gao值，应将样本用稀释剂（1×）稀释后重新检测；若细胞 培养上清液样本需分布稀释，除最hou一步用稀释剂稀释外，其它中间稀释可采用细胞培养基；
5、检测结果的不同可由多种因素引起，包括实验人员的操作、移液器的使用方式、洗板技术、 反应时间或温度、试剂盒的储存等。研究领域 研究领域 Drug DiscoverySmall Molecule DrugLead Compound DiscoveryHuman PD-L1/B7-H1 ELISA Kit温馨提示：本产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究