92 kDa gelatinase, 92 kDa type IV collagenase, CLG4B, EC 3.4.24, EC 3.4.24.35, Gelatinase B, GELB, macrophage gelatinase, MANDP2, matrix metallopeptidase 9, matrix metalloproteinase 9, matrix metalloproteinase-9, MMP9, MMP-9, type V collagenase

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人MMP-9抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生wu素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的MMP-9与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考校正波长540nm或570nm）测定吸光度值。

Human

31.3pg/mL-2000pg/mL

需自备试验器材
1. 酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸头
3. 蒸馏水或去离子水
4. 洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5. 500mL量筒

一、实验前准备
1. 样品搜集及储存
①细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
②血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置30分钟。离心15分钟，转速为1000g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
③血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后30分钟内离心15分钟，转速为1000g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
2. 试剂配制（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）
①1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取10mL浓缩洗涤液+190mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
②1×稀释用缓冲液配制：试剂盒中的浓缩稀释用缓冲液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释至1×工作液。例：取3mL浓缩稀释用缓冲液+27mL蒸馏水定容至30mL。实际操作时可先依据样本稀释倍数，计算所需的稀释用缓冲液用量，再进行配制。
③检测抗体：将干粉离心至管底，使用110uL稀释用缓冲液（1×）溶解，室温静置5分钟后得到100×母液；使用前需稀释为1×工作液。按照每孔用量100uL计算所需体积。例：使用了10个孔，则取10uL的100倍工作浓度的检测抗体，使用稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
④SA-HRP：SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100uL。例：使用了10个孔，则取25uL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
⑤显色液：按每孔100uL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色液，避光；取出的显色液仅供当日使用。
⑥标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液（1×）重溶，重溶体积1000uL，得到浓度为2000pg/mL标准品母液。轻轻震摇至少5分钟，其充分溶解。每个稀释管中加入300uL稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释，每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点（2000pg/mL），稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0pg/mL）。


二、操作步骤
1. 准备好所有需要的试剂和标准品；
2. 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4. 分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时;
5. 将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6. 在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；
7. 重复第5步洗板操作；
8. 在每个微孔内加入100uLSA-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；
9. 重复第5步洗板操作；
10. 在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30分钟，注意避光；
11. 在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12. 加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13. 计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。
注：提供的标准曲线数据仅供参考，应根据同次试验所绘标准曲线计算样本含量。

三、试剂盒参数
1. 回收率：在细胞培养基样本中掺入不同水平的Human MMP-9， 测定其回收率。 回收率范围在85-104%，平均回收率在97%。 
2. 灵敏度：Human MMP-9的zui低可测剂量（MDD）一般在0.156ng/mL。zui低可测值是根据20个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3. 校正：此 ELISA 试剂盒经大肠杆菌表达的高纯度重组Human MMP-9蛋白所校正。
4. 线性：4个不同的样本中掺入高浓度的Human MMP-9，然后用稀释剂（1×）将样本稀释到检测范围内，测定其线性。

5. 特异性：此 ELISA 法可检测天然及重组人分子量为92kDa MMP-9 蛋白原肽及 82kDa 激活形式的 MMP-9 蛋白，不能测定分子量为 65kDa 的 MMP-9 蛋白。将以下因子用稀释剂(1×) 配置成 100ng/mL或 200ng/mL 的浓度来检测与Human MMP-9 的交叉反应。将 200ng/mL 的干扰因子掺入中间范围的重组Human MMP-9 对照品中，来检测对Human MMP-9 的干扰。没有观察到明显的交叉反应或干扰。



四、常见问题解析
1. 白板（显色完成后，无颜色出现）

2. 花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）

五、实验流程图

基质金属蛋白酶（MMPs）也被称为matrixins，是锌钙依赖性蛋白水解酶家族成员，可分解细胞外基质（ECM），在不同的亚细胞环境中，参与多种分子的加工过程。MMPs在众多生理学进程中发挥重要功能，例如胚胎发育、形态发生、繁殖以及组织重构。也参与炎症以及自身免疫疾病，例如关节炎、癌症和心血管疾病。新合成的MMPs的量主要在转录水平被调节，已经存在的MMPs的蛋白水解活性，不仅受控于酶原的活性，也受控于内源性抑制剂对酶活性的抑制，例如α2-巨球蛋白，以及金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）。
MMP-9（也称明胶酶B、92kDaIV型胶原酶、92kDa明胶酶、V型胶原酶）作为糖基化酶原被分泌出来。酶原的活化涉及到N-末端前体区域的蛋白水解去除，最终形成82kDa的活性酶。活性人MMP-9与小鼠和大鼠的MMP-9分别有72%和74%的氨基酸序列同源性。除了锌结合位点，催化结构域还包含三个连续的纤连蛋白II型同源单位，可结合明胶。富含脯氨suan的铰链区将催化结构域连接到C-末端血红素样结构域。在体外实验中，酶原经4-氨基苯基乙酸乙酯（APMA）处理后，不仅能产生活性酶，还能产生活性与其相当的C-末端截短形式。MMP-9可降解ECM中的成分，尤其对变性胶原（明胶）有非常高的特异性。MMP-9也可裂解III、IV、V、XI型胶原，以及弹性蛋白、巢蛋白-1和玻连蛋白。MMP-9还可裂解多种趋化因子和生长因子（例如IL-1β、CXCL8/IL-8、CXCL7、CXCL4、CXCL1、LatentTGF-β、膜结合TNF-α、VEGF和FGFbasic），β-淀粉样蛋白、P物质、髓鞘碱性蛋白。此动作可提高或降低这些可溶性因子的生物活性，也可使它们从与ECM的联合中被释放出来。MMP-9也可通过各种各样的膜蛋白触发信号通路，或是诱导它们从细胞膜上脱落从而抑制信号通路（例如CD44，E-钙黏蛋白、整合素、ICAM-1和IL-2Rα）。
MMP-9由多种正常细胞和转化细胞产生，包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、星形胶质细胞、纤维原细胞、破骨细胞、软骨细胞、角化细胞、内皮细胞和上皮细胞。它影响生理性和病理性的血管生成和血管重构。活化的中性粒细胞释放MMP-9前体，不结合TIMP-1，允许促血管生成的FGF-2从ECM中释放出来。MMP-9和TIMP-1的复合物不能诱导FGF-2的释放。中性粒细胞来源的MMP-9可加剧炎症反应，通过产生来自胶原多肽来诱导额外的中性粒细胞MMP-9的释放。MMP-9在骨形成和重构、jia基苯丙an诱导行为敏化与应答、神经元突触重构的调控、着床过程中的滋养层入侵、丝氨suan蛋白酶抑制剂α1的活化中也发挥重要作用。MMP-9介导的粘附分子的脱落对于肿瘤细胞的侵袭也有直接作用。
MMP-9的循环水平在许多炎症失调疾病中有所升高，包括管腔内血栓的形成、动脉粥样硬化、克罗恩氏病、丙型肝炎病毒感染、结肠直肠癌以及杜氏肌营养不良。MMP-9与TIMP-1的比例在多发性硬化症血清和囊性纤维化痰中升高，但在巨细胞病毒感染的血清中降低。游离MMP-9的水平、MMP-9与脂质运载蛋白-2/NGAL复合物的水平分别在卵巢癌患者、子宫尿道感染患者的尿液中升高。

Human

未开封试剂盒，2-8°C储存。

1. 请在试剂盒有效期内使用。
2. 不同试剂盒及不同批号试剂盒的组分不能混用。
3. 样本值若大于标准曲线的最高值，应将样本用稀释剂（1×）稀释后重新检测；若细胞培养上清液样本需分布稀释，除最后一步用稀释剂稀释外，其它中间稀释可采用细胞培养基。
4. 检测结果的不同可由多种因素引起，包括实验人员的操作、移液器的使用方式、洗板技术、反应时间或温度、试剂盒的储存等。
5. 试剂盒中的终止液是酸性溶液，使用时请做好眼镜、手、面部及衣服的防护。
6. 仅供科研使用，不可用于体外诊断。