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Human IL-10 ELISA Kit采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人IL-10抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生wu素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的IL-10与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考校正波长540nm或570nm）测定吸光度值。

Human

31.3pg/mL-2000pg/mL

需自备试验器材
1. 酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸头
3. 蒸馏水或去离子水
4. 洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5. 500mL量筒

一、实验前准备
1. 样品搜集及储存
①细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
②血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置30分钟。离心15分钟，转速为1000g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
③血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后30分钟内离心15分钟，转速为1000g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
2. 试剂配制（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）
①1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取10mL浓缩洗涤液+190mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
②1×稀释用缓冲液配制：试剂盒中的浓缩稀释用缓冲液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释至1×工作液。例：取3mL浓缩稀释用缓冲液+27mL蒸馏水定容至30mL。实际操作时可先依据样本稀释倍数，计算所需的稀释用缓冲液用量，再进行配制。
③检测抗体：将干粉离心至管底，使用110uL稀释用缓冲液（1×）溶解，室温静置5分钟后得到100×母液；使用前需稀释为1×工作液。按照每孔用量100uL计算所需体积。例：使用了10个孔，则取10uL的100倍工作浓度的检测抗体，使用稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
④SA-HRP：SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100uL。例：使用了10个孔，则取25uL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
⑤显色液：按每孔100uL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色液，避光；取出的显色液仅供当日使用。
⑥标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液（1×）重溶，重溶体积1000uL，得到浓度为2000pg/mL标准品母液。轻轻震摇至少5分钟，其充分溶解。每个稀释管中加入300uL稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释，每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点（2000pg/mL），稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0pg/mL）。



二、操作步骤
1. 准备好所有需要的试剂和标准品；
2. 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4. 分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时;
5. 将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6. 在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；
7. 重复第5步洗板操作；
8. 在每个微孔内加入100uLSA-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；
9. 重复第5步洗板操作；
10. 在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30分钟，注意避光；
11. 在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12. 加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13. 计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。
注：提供的标准曲线数据仅供参考，应根据同次试验所绘标准曲线计算样本含量。

三、试剂盒参数
1. 回收率：在细胞培养基样本中掺入不同水平的人 IL-10， 测定其回收率。 回收率范围在88-110%，平均回收率在98%。 
2. 灵敏度：Human IL-10的zui低可测剂量（MDD）一般在3.9pg/mL。最di可测值是根据20个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3. 校正：此 ELISA 试剂盒经sf 21表达的高纯度重组Human IL-10蛋白所校正。
4. 线性：4个不同的样本中掺入高浓度的Human IL-10，然后用稀释剂（1×）将样本稀释到检测范围内，测定其线性。




四、常见问题解析
1. 白板（显色完成后，无颜色出现）

2. 花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）










五、实验流程图

人白细胞介素10（IL-10），又称为细胞生长因子合成抑制因子（CSIF），是IL-10α螺旋家族的成员，该家族还包括IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26/ak155。IL-10可由多种活化的造血细胞、肝星状细胞、角质形成细胞和胎盘滋养叶细胞分泌。人类IL-10对小鼠细胞有活性，而小鼠IL-10不能作用于人的细胞。成熟的人IL-10与马IL-10有86%的氨基酸序列同源性，与牛、犬、猫、豚鼠、小鼠、绵羊、猪和大鼠IL-10的同源性在72-80%之间。它包含两个链内二硫键，以非共价结合的同源二聚体形式表达，分子量36kDa。
IL-10通过由II型细胞因子IL-10受体亚基α和β异源二聚体复合物介导其生物活性。IL-10受体α亚基是一个110kDa的跨膜糖蛋白，主要表达于淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、星形胶质细胞、肠上皮细胞、滋养层细胞和活化的肝星状细胞，而75kDa的跨膜受体β则广泛表达。IL-10二聚体结合两个IL-10Rα链，激发两个IL-10Rβ链的加入。IL-10Rβ不直接结合IL-10，但为信号转导所需要。IL-10Rβ还与IL-20Rα、IL-22Rα1及IL-28Rα形成IL-22、IL-26、IL-28和IL-29的受体复合物。
IL-10参与的免疫调节包括抑制作用和刺激作用。它通过抑制Th1细胞和Th17细胞的扩增和活化，促进M2型巨噬细胞发挥抗炎作用。免疫调节T细胞（Treg）和调节性B细胞对IL-10表达的调节对Treg增殖有重要意义。然而，在肿瘤环境中，IL-10抑制Treg及髓源性抑制细胞的增殖。IL-10诱导CD8T细胞在肿瘤中的积累和活化。IL-10通过限制关节炎的组织损伤，促进肌肉损伤后再生发挥保护作用，但它可能导致病毒感染的持久性。IL-10水平在干燥综合征（唾液）、原发性中枢神经系统淋巴瘤（脑脊液）、卵巢癌（血清和腹水）中升高。其水平在心脏病复发或子娴前期患者血清和男性不育患者精液中降低。

Human

未开封试剂盒，2-8°C储存。

1. 请在试剂盒有效期内使用。
2. 不同试剂盒及不同批号试剂盒的组分不能混用。
3. 样本值若大于标准曲线的最高值，应将样本用稀释剂（1×）稀释后重新检测；若细胞培养上清液样本需分布稀释，除最后一步用稀释剂稀释外，其它中间稀释可采用细胞培养基。
4. 检测结果的不同可由多种因素引起，包括实验人员的操作、移液器的使用方式、洗板技术、反应时间或温度、试剂盒的储存等。
5. 试剂盒中的终止液是酸性溶液，使用时请做好眼镜、手、面部及衣服的防护。
6. 仅供科研使用，不可用于体外诊断。