多重荧光免疫组化染色是基于抗原、抗体特异性结合的原理，选用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗抗体，对试剂盒中的荧光染料进行活化，将信号共价结合到抗原上。借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色。

TSA单色荧光染料520、TSA单色荧光染料570、TSA单色荧光染料650、信号放大反应液、鼠兔通用型HRP标记二抗、抗荧光淬灭封片剂、DAPI.

主要用于组织、石蜡切片、TMA芯片的免疫组化染色。也可用于冰冻切片和细胞爬片，需搭配abs994 抗体洗脱液（mIHC专用）。

一、样本要求
1、福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA，封蜡不能有明显的破损。
2、玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。
3、组织最小应包含大于1000个细胞。
4、蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿剌物、细胞甩片样品会影响染色效果。
5、组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18-24h。
6、切片厚度为4um左右，使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。
7、不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、中央。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴，不要用纸擦拭玻片。
8、玻片置于45℃热盘上放置30min（自然风干玻片时长不小于1h）。

二、检验方法
1、所需仪器设备：移液器、恒温干燥箱、微波炉、免疫组化笔、修复杯、染色缸、计时器、孵育湿盒、盖玻片、通风橱、洗瓶、荧光显微镜、量筒100ml、量筒1000ml等。
2、所需试剂：灭菌去离子水（abs9259）、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、10%中性福尔马林、抗原修复一抗、封闭液、TBST等。
3、试剂准备：
1）荧光染料的稀释：染料为100×母液，使用信号放大反应液按1:100稀释制备染料工作液（现用现配）；DAPI使用无菌水按1:100稀释制备工作液。
2）二抗的使用：试剂盒为鼠兔通用二抗，不建议样本与二抗同源，实验前请核实一抗种属是否匹配。
4、检测设备：荧光显微镜或荧光全片扫描设备，TSA单色荧光染料适用的激发和发射滤光片应符合表中的建议。

三、石蜡切片操作步骤
1、脱蜡水合
a）新鲜二甲苯浸片10min，重复3次。
b）梯度乙醇浸片：100% 5min；95% 5min；70% 2min。
c）灭菌水洗片1min，重复3次。
d）10%中性福尔马林或4%多聚甲醛浸片10-30min，灭菌水洗片1min，重复3次。（可选项，视样本质量而定）
e）滴加破膜剂通透15min，PBST浸洗3min，重复3次。（可选项，一般情况下可不做）
2、微波修复抗原
a）将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液1×工作液浸没。
b）将修复杯置于微波炉内高火煮沸。
c）低火维持15min（注意补液，防止蒸发过度导致干片）。
d）取出室温自然冷却至室温。
3、淬灭和封闭
a）去除玻片上残存洗液。
b）用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加3%过氧化氢覆盖样本区域，孵育10min，PBST浸洗3min，重复3次。
c）去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。
4、一抗孵育
a）去除玻片上的封闭液。
b）用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。
c）室温保湿震荡孵育1h（需针对不同抗体做优化调整）。
d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。
5、二抗孵育
a）去除玻片上残存的洗液。
b）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域。
c）室温保湿孵育10min。
d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。
6、荧光染色放大信号
a）去除玻片上残存的洗液。
b）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul（使用信号放大液按1:100稀释）浸没样本区域。
c）室温保湿震荡孵育10min。
d）1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3min。重复3次。
e）微波修复，室温自然冷却至室温。
f）灭菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。
7、新一轮染色（单染可直接进行第8步）
a）每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST覆盖样品，防止干片。
b）封闭：去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。（无需淬灭步骤）
c）重复步骤4-6
d）多轮染色重复步骤7，a）— c）结束后进行染核及封片
8、染核及封片
滴加1×DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。
9、阅片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。

四、冰冻切片操作步骤（需搭配抗体洗脱液abs994）

1、淬灭、通透、封闭

a）从冰箱中取出冷冻玻片，恢复至室温，PBST浸洗3min，重复3次

b）10%中性福尔马林或4%多聚甲醛浸片10-30min，灭菌水洗片1min，重复3次。（可选项，视样本质量而定）

c）滴加破膜剂通透15min，PBST浸洗3min，重复3次。（可选项，一般情况下可不做）

d）用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加3%过氧化氢覆盖样本区域，孵育10min，PBST浸洗3min，重复3次。

e）去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。

2、一抗孵育

a）去除玻片上的封闭。

b）用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。

c）室温保湿震荡孵育1h（需针对不同抗体做优化调整）。

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。

3、二抗孵育

a）去除玻片上残存的洗液。

b）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域。

c）室温保湿孵育10min。

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。

4、荧光染色放大信号

a）去除玻片上残存的洗液。

b）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul（使用信号放大液按1:100稀释）浸没样本区域。

c）室温保湿震荡孵育10min。

d）1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3min。重复3次。

e）滴加抗体洗脱液（abs994），37℃孵育15-20min。

f）灭菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。

5、新一轮染色（单染可直接进行第6步）

a）每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST覆盖样品，防止干片。

b）封闭：去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。

c）重复步骤2-4。

d）多轮染色重复步骤5，结束后进行染核及封片。

6、染核及封片

滴加1×DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。

7、阅片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。

五、结果说明：

1、微波修复抗原、孵育时间、温度的改变均有可能得出错误结果。

2、在每次染色过程中，必须有组织阳性对照和试剂阴性对照实验同时进行。

3、若阳性组织对照不能显示阳性染色，则应判定该批次样本的检测结果无效。

六、产品性能指标：

1、符合性：取符合性组织片（包括阳性组织片和阴性试剂对照），经相应的免疫组化试验后，阳性对照染色结果为阳性，阴性对照染色结果为阴性。

2、批内重复性：取同一批次的试剂盒，检测同一组织切片3片，染色结果应一致。

七、染料信息表格

八、其他产品推荐

荧光染料需避光保存，2～8℃储存，收到货起有效期为12个月。

1. 本试剂盒只用于免疫组化，不做其他用途。
2. 本试剂盒仅限于专业人员使用。
3. 应采用适当的防护措施，以避免试剂同皮肤和眼睛接触。
4. 超过有效期的试剂活性可能降低，因此不得使用超过有效期的试剂。
5. 若将本试剂盒的染色组分与其他公司的产品混合使用，在染色过程中可能出现异常情况。
6. 脱蜡不全，容易影响染色效果。
7. 为了防止可能出现的假阴性、假阳性结果，实验过程中需有阳性对照及阴性对照同时进行。
8. 使用本试剂盒中所产生的各种废弃物都应按照《医疗废物管理条例》进行处理。

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