注：  Lysis buffer 使用前，立刻加入 1 mM PMSF（终浓度）（推荐购买abs9146，自行配制）。

一、制备细胞裂解物：
1、吸干培养基。添加含有调节分子的新鲜培养基，使其在预定的时间内对细胞进行处理。
2、收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1 X PBS 洗涤细胞一次。
3、去除 PBS 并在每个细胞板上（10 cm）加入 0.5 mL 冰预冷的 Lysis buffer，并在冰上孵育至少5分钟。
4、从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5、在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。（PS：超声条件需根据液体量、探头直径以及最大功率调整。以200W功率超声仪器为例，用 3 mm 的探头。我们一般推荐使用 35%-40% 的最大功率进行 3 次超声脉冲， 每次超声之间停顿 10 秒。）
6、在 4 °C，在 14,000 x g 条件下，微量离心10分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 -80 °C。
注：细胞裂解物制备好之后，可先进行蛋白免疫印迹法检测，以此来确定细胞裂解物里存在目标蛋白。

二、免疫沉淀法：
1、细胞裂解物预清除（可选步骤）
（1）向 500 μL（含总蛋白 200 -1000 ug）细胞裂解物中添加 5 μL Protein A 和 5 μL Protein G。
（2）在 4 °C 下，旋转孵育 30 - 60 分钟。
（3）4°C 条件下 12000g 离心1分钟，保留上清，待用。
2、抗原抗体结合
（1）在新的离心管内加入 500 μL（含总蛋白 200 – 1000 ug）细胞裂解物（可以是预清洗后的细胞裂解物）。
（2）加入目标蛋白的单克隆/多克隆抗体（1 – 5 μg）。
（3）同时采用非特异免疫的同源抗体作为对照。
（4）在 4 °C 轻柔混合过夜。
3、免疫复合物沉淀
（1）抗体孵育过夜后，加入 5 μL Protein A 和 5 μL Protein G。
（2）在 4 °C 温和地混匀1-3小时或过夜。
（3）12,000 g 离心1 分钟，保留沉淀。
（4）使用 0.5 mL 1*Wash buffer 清洗沉淀，12,000 g 离心1分钟，保留沉淀。
（5）重复第4步，共计清洗3次。
注：清洗，去上清的时候需要注意避免吸走填料
4、用蛋白免疫印迹法进行分析
（1）在 20 - 40 μl 1*SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，涡旋振荡，然后再微量离心30秒，以使附着管壁的珠子和液体到管底。
（2）将样品加热至 95 - 100 °C 并持续2 - 5分钟，然后在 14,000 g下瞬时离心1分钟，取上清液。
（3）将样品（15 – 30 μL）上样到 SDS-PAGE 凝胶上。
（4）用蛋白质印迹法分析样品。

本试剂盒4℃保存，1年有效。
注意：Protein A和Protein G的基质为20%乙醇，较易挥发，使用时应注意密封，如出现挥发情况，可使用20%乙醇重悬。