一瓶小小的双色染料，竟能让我们看清细胞的生与死

在细胞生物学研究中，准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞至关重要。AO/PI双染试剂盒作为一种高效的细胞状态检测工具，通过荧光双色标记，让研究人员能够快速、精准地掌握细胞的生命状态。

一、AO/PI双染试剂盒：原理与组成

AO/PI双染试剂盒是基于两种荧光染料——吖啶橙和碘化丙啶的独特特性而设计的细胞状态检测工具。

吖啶橙

吖啶橙是一种具有膜通透性的荧光染料，能够透过所有类型细胞的细胞膜，与细胞内的DNA和RNA结合。它与DNA结合时发出绿色荧光（最da发射波长约530nm），与RNA结合时则发出红色荧光（最da发射波长约640nm）。在细胞正常状态下，AO使细胞核呈现绿色或黄绿色均匀荧光。

碘化丙啶

碘化丙啶则是一种非细胞膜通透性染料，它只能进入细胞膜受损的细胞（如坏死细胞），并与DNA结合产生红色荧光（最da发射光波长为617nm）。对于细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞，PI无法进入。

这两种染料的巧妙组合，使得研究人员能够在一次实验中对不同状态的细胞进行区分：活细胞显示绿色，坏死细胞显示红色，而凋亡细胞则因染色质固缩或断裂，被AO染上致密浓染的黄绿色荧光或呈现黄绿色碎片状。

试剂盒通常提供4种不同浓度的AO/PI组合，用户可以根据实验需求和所用细胞计数仪的特性，选择最合适的配比，甚至可以自行混合调整染料浓度，以获得最jia染色效果。

二、多领域应用：这些实验都需要AO/PI双染

1. 细胞活力与毒性检测

在药物筛选和毒性测试中，AO/PI双染是评估化合物对细胞影响的关键技术。通过统计活细胞与死细胞的比例，研究人员可以快速判断药物的细胞毒性强弱，为药物开发提供重要参考数据。

2. 细胞凋亡研究

在癌症研究和治疗反应监测中，该试剂盒能够有效区分凋亡细胞与坏死细胞。凋亡细胞会显示致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒，而坏死细胞则呈现强烈的红色荧光。这种区分对于研究化疗药物诱导的细胞死亡机制尤为重要。

3. 免疫细胞功能分析

在免疫学研究中，特别是在评估细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）等免疫细胞的活性和数量时，AO/PI双染法表现出高度可靠性。有研究验证了该方法在检测CIK细胞培养全过程及冻存复苏后细胞状态中的有效性。

4. 三维细胞培养分析

传统的二维细胞培养活性检测方法往往不适用于复杂的3D模型。而AO/PI双染试剂盒（如Cyto3D Live-Dead Assay Kit）专为3D和2D细胞培养设计，能够有效评估3D培养体系中的细胞存活率。

5. 血液学与免疫学应用

在外周血单个核细胞分析中，AO/PI双染法具有独特优势。研究表明，它能够在不裂解红细胞的情况下精确计数PBMC并进行活力分析，避免了因裂解操作导致的计数误差。

6. 细胞治疗与再生医学

在细胞治疗产品（如干细胞、免疫细胞）的制备和质量控制中，AO/PI双染是评估细胞活性的标准方法。它确保只有高质量、高活力的细胞产品才会用于临床治疗。

三、实验操作指南：从准备到结果分析

样本准备

• 悬浮细胞：直接收集细胞，用PBS洗涤两次后重悬于染色缓冲液中，调整细胞密度至1×10^6 cells/mL左右。

• 贴壁细胞：可用胰酶（不含EDTA）消化后制备成细胞悬液，或直接在培养板中原位染色。

染色过程

1. 取90-100μL细胞悬液，加入等体积或适当比例的AO/PI双染试剂

2. 轻轻吹打混匀，室温避光孵育5-10分钟

3. 对于某些实验，可能需要用PBS洗涤两次后再进行检测

检测与分析

• 荧光显微镜观察：使用FITC滤光片观察AO绿色荧光（活细胞），Cy3滤光片观察PI红色荧光（死细胞）

• 流式细胞仪分析：设置合适的荧光通道，AO绿色荧光通常检测FITC通道，PI红色荧光检测PE或Cy3通道

• 自动细胞计数仪：专为细胞计数仪设计的试剂盒可直接上样分析

结果判读

• 活细胞：细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光

• 早期凋亡细胞：染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，呈致密浓染的黄绿色

• 晚期凋亡细胞：显示红色荧光，但细胞形态可能已发生变化

• 坏死细胞：呈强烈的红色荧光，细胞结构不完整

四、优势与局限性：明智选择实验方案

技术优势

1. 快速高效：整个染色过程通常在5-15分钟内完成，适合快速检测

2. 操作简便：无需复杂的样本前处理，减少了操作步骤和误差引入

3. 区分度高：能清晰区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，提供全面的细胞状态信息

4. 应用广泛：兼容多种检测平台，包括荧光显微镜、流式细胞仪、自动细胞计数仪等

5. 灵敏度高：能够检测早期的细胞凋亡变化，优于传统的台盼蓝染色法

局限性与注意事项

1. 荧光淬灭：荧光染料均存在淬灭问题，需注意避光保存和操作

2. 时间敏感性：染色后需要尽快检测，否则会影响结果准确性

3. 设备依赖：需要荧光检测设备，可能不适用于基础实验室

4. 毒性物质：PI是已知的诱变剂，操作时应采取适当防护措施

5. 优化需求：不同细胞类型可能需要调整染料浓度和染色时间，建议xian进行预实验优化条件

五、与其他方法的比较

与传统的台盼蓝排除法相比，AO/PI双染不仅能够区分活死细胞，还能识别凋亡细胞，提供更全面的细胞状态信息。

与Annexin V-FITC/PI双染法相比，AO/PI更侧重于细胞膜的完整性和核染色质的变化，而Annexin V/PI则检测磷脂酰丝氨酸外翻，两者在凋亡检测的不同阶段各有优势。

总结

AO/PI双染试剂盒作为细胞状态检测的重要工具，以其快速、准确、多参数的优势，在生物医学研究的多个领域发挥着不可替代的作用。无论是基础的细胞培养质量控制，还是前沿的药物研发与疾病机制研究，掌握这一技术都将为科研工作提供有力支持。

随着细胞分析技术的不断发展，AO/PI双染试剂盒的应用前景将更加广阔，特别是在3D细胞模型、实时动态监测等新兴领域，它将继续帮助我们看清微观世界的生命奥秘。

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