完整操作指南

遵循以下步骤进行实验，可保障实验流程的规范性与结果的准确性，各环节关键参数已经过优化验证：

1.样品处理：取制备好的蛋白裂解液，与2*上样缓冲液按等体积比例混合，充分混匀后于100℃加热煮沸10min，随后以12000rpm转速离心5min，取适量上清液用于上样。

2.电泳分离：使用新鲜配制的电泳液，先以90V电压电泳20min使样品充分浓缩，随后调整电压至120V，继续电泳直至蛋白分离达到预期效果。

3.转膜操作：采用配制完成的电转液，设置100V恒压条件进行电转，转膜时间为90min，确保蛋白质高效转移至PVDF膜上。

4.封闭处理：用1*TBST缓冲液配制5%的脱脂奶粉或BSA封闭液，将转膜后的PVDF膜置于封闭液中，在室温摇床上孵育60min，以封闭膜上的非特异性结合位点。

5.一抗孵育：将封闭后的膜与稀释好的特异性一抗孵育，置于2-8℃低温摇床上孵育过夜，确保一抗与靶蛋白充分结合。

6.洗涤除杂：弃去一抗孵育液后，用1*TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min，去除未结合的游离一抗。

7.二抗孵育：加入试剂盒配套的anti-mouse-HRP二抗（#abs20001），在室温摇床上孵育60min，使二抗与一抗特异性结合。

8.二次洗涤：同步骤6，用1*TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min，去除未结合的二抗，避免背景干扰。

9.显色曝光：取显色A液与显色B液按等体积比例混合，将混合后的显色液均匀铺满整张膜，反应2min后，即可通过化学发光成像系统进行曝光检测。