一、实验前准备

1、动物：6–8周性周期规律的SD大鼠（体重180–220g）。

2、主要试剂

• DMEM/F12基础培养基（abs9560）

• 胎牛血清（abs972）

• ITS （abs9462）

• 双抗（abs9244）

• 组织解离液（abs9482）

• 0.25%胰蛋白酶-EDTA（abs47014938）

• 10xPBS（abs961）

• 1xPBS（abs962）

• Percoll（abs9102）

• 70um细胞筛网（abs7232）

• 细胞培养皿（35mm）（abs7004）

• 细胞培养皿（60mm）（abs7005）

• 1mL注射针头

• 抗体：CYP17A1（兔多抗，标记TC）和FSHR（兔多抗，排除颗粒细胞）

二、卵泡膜细胞提取与分选

1、卵巢取材

颈椎脱臼处死 → 75%乙醇消毒 → 迅速摘取双侧卵巢 → 置于冰DMEM/F12（+1%双抗）中。

2、卵泡预处理

（1）用显微镊撕去卵巢被膜及黄体 → 将卵巢置于35mm皿中，加入1mL DMEM/F12。

（2）用1mL注射针头反复穿刺卵泡，释放并弃去颗粒细胞-卵母细胞复合体，保留卵泡残余壁（富含膜细胞）。

3、酶消化

（1）将卵泡残余壁剪碎成0.5-1mm³ 的小组织块，将组织块（100-200mg）转移到2mL圆底管中，加入1mL消化液（abs9482），37℃水平摇床80rpm的速度轻轻摇动孵育30-40min（根据组织糜烂状态适当延长时间）

（2）从水平摇床中取出圆底管，剧烈涡旋管10-20s，通过70um细胞筛网（abs7232）过滤，用10mL PBS冲洗细胞筛网;

（3）收集含有细胞的滤液到50mL管中，20℃下400g离心5min，弃上清。

4、Percoll密度梯度纯化

（1）35% Percoll溶液

Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10x)按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液。

用100% Percoll母液和1xPBS按体积比7:13混合，配制35%等渗Percoll溶液。

（2）50% Percoll溶液

Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10x)按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液用100% Percoll母液和1xPBS按体积比1:1混合，配制50%等渗Percoll溶液

（3）吸取1mL 50% percoll深入到15mL离心管底部

（4）用2mL，35% percoll （abs9102）重悬细胞沉淀，沿着管壁缓慢加入含1mL 50% percoll离心管中，覆盖在50%Percol 溶液的顶部形成密度梯度

▲ 注意：不要破坏35% Percoll和50% Percoll与细胞的悬液的分界面，35%和50% percoll现配现用

（5）400xg，20℃，离心10 min，升速(ACC)1，降速(DEC)1

（6）离心结束后，吸取中间35%/50%界面层细胞（富含TC）至新的15mL离心管中，加入3倍体积4℃预冷1xPBS，上下颠倒混匀， 4℃下400g离心5min，弃上清

（7）按照步骤 （6） 重复清洗一次，弃上清得到细胞

5、差速贴壁进一步去杂

（1）将细胞重悬于 DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗，接种于 6cm 皿，37℃、5% CO₂ 孵育 2h。

（2）轻轻吸去未贴壁的颗粒细胞，换新鲜培养基继续培养。

6、纯度鉴定

（1）取培养 24h 的细胞做免疫荧光：CYP17A1⁺/FSHR⁻ 判定为 TC，纯度通常 > 90%。

（2）亦可做 qPCR 检测 Lhcgr、Cyp17a1 高表达，而 Fshr 低表达。

三、培养与传代

1、培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% ITS + 1% 双抗。

2、每 2–3 天换液；细胞长至 80% 汇合时，0.25% 胰酶-EDTA 消化 1–2 min，1:3 传代。

3、前 3 代以内功能很稳定，建议实验在此窗口内完成。

四、注意事项

1、消化时间勿超 90min，以免降低活率。

2、Percoll离心后收细胞时，界面层需精准吸取，避免混入红细胞或颗粒细胞。

3、若需无血清实验，可把 FBS 降至 2% 并添加 ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）。

今天讲解就到这了，大家如有细胞培养问题，欢迎一起交流哦！

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