1、靶抗原（Target Antigen）

ADC药物设计起始于靶抗原，其选择需满足：

（1）特异性，肿瘤细胞高表达、正常细胞低表达或不表达；

（2）为肿瘤细胞表面抗原；

（3）能高效诱导内化过程等。

靶点蛋白的选择直接关系到ADC的靶向性、治疗效果以及安全性。爱必信深耕靶点蛋白研发领域，拥有超过 2800 种高质量靶点蛋白资源库，其中ADC热门靶点蛋白全覆盖，广泛应用于免疫原制备、高通量抗体筛选、细胞信号通路研究及功能机制验证等场景。

大部分ADC药物的疗效主要基于内化后药物释放，即抗体与肿瘤细胞表面抗原结合形成的ADC-抗原复合物，需有效诱导内化，进入肿瘤细胞并经细胞内转运和降解，实现小分子药物释放。通过细胞免疫荧光将ADC内化情况可视化（图3），DT3C含量检测定量内化效率（图4）。DT3C(Diphtheria Toxin Fragment A and Streptococcus Protein G C1, C2,C3)是一种重组表达的融合蛋白，该蛋白能够与抗体的Fc端高度亲和，与抗体结合的DT3C分子在抗体被内吞时一同进入细胞。DT3C可以与任何lgG型抗体结合，因此可用于检测来自不同物种的抗体内化效率。

2、抗体（Antibody）

ADC药物中的抗体需要满足：高特异性、强靶点结合能力、低免疫原性、低交叉反应活性，以达到肿瘤细胞对ADC药物更高效的摄入和ADC药物在血清中更长的半衰期。

免疫球蛋白G (IgG) 是ADC中使用的主要抗体骨架。所以，临床和临床前研究的ADC药物通常选择IgG作为靶向目的抗原的抗体。IgGs可分为四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 。其中，IgG1由于能够较好地平衡长血液半衰期和强免疫激活的关系，并且有着较高的自然丰度，是被研究和采用最多的ADC抗体。IgG4由于较低的免疫激活效应也经常被采用在一些对免疫原性反应要求较高的ADC药物设计中。

图5 不同IgG对比[2]

3、有效载荷（Payload）

ADC所携带的细胞毒性载荷药物即有效载荷是其最重要的效应成分。目前，常用的细胞毒性分子包括微管生成抑制剂、DNA 损伤因子和DNA转录抑制剂等。

选择小分子药物时，需要满足：

（1）IC50值低至纳摩尔级别甚至皮摩尔级别；

（2）在与抗体偶联后不易引起ADC药物发生聚集，以保证在体内拥有较长的循环时间；

（3）本身以及形成后的ADC药物需具有较低的免疫原性；

（4）在水溶液（血液）中足够稳定且具有合适的反应位点通过连接子与抗体偶联，偶联后仍然能够保证其生物活性；

（5）可以通过相对具有经济效益的过程合成。

4、连接子（Linker）

连接子（Linker）在ADC结果中起着至关重要的作用，其会影响ADC的药代动力学参数、治疗指数和药效。Linker可维持ADC复合物在血流中的稳定性，并最大限度地减少非靶向效应。而且，在肿瘤细胞内化ADC的过程中，Linker应能够快速释放细胞毒性药物。

根据可裂解性质Linker分为可裂解Linker和非可裂解Linker，可裂解Linker可进一步分为腙、二硫化物和肽Linker三种类型（表1）。非可裂解Linker包括不可降解的硫醚或马来酰亚胺己酰基（Maleimidocaproyl，MC），其在ADC中Payload内化至靶癌细胞后经溶酶体酶降解。合理选择和优化Linker及其与Payload的偶联策略可有效提高ADC的治疗效果和减少脱靶效应。

5、偶联技术

偶联技术将抗体与有效载荷相连，和最终的药物抗体比率（Drug to Antibody Ratio, DAR）密切相关。DAR 为每个 mAb 连接的有效载荷平均数量，可经 HPLC - MS 等测得，对药物药理学和活性影响显著，是 ADC 研发后期关键参数。因肿瘤细胞摄入 ADC 数量有限，较高 DAR 有利于提高效力，但小分子药物疏水性强，DAR 过高会使 ADC 聚集，缩短体内循环半衰期且增加毒副作用，故临床前和临床用DAR 通常在 2 - 8 之间。

偶联方式主要分为非定点偶联和定点偶联。早期使用的是非定点偶联法，主要由赖氨酸或半胱氨酸偶联。定点偶联方式即通过基因工程位点进行特异性偶联，实现更均一的ADC，能在特定位点实现细胞毒素的连接。

酶学偶联法

Sortase A（abs05842）通过识别目标蛋白上的特定肽序列，通常是LPXTG（X可以是任何氨基酸），并在苏氨酸（T）和甘氨酸（G）残基之间进行切割（图6）。Sortase A介导的抗体偶联（SMAC）技术允许在抗体上预先设定的位点上高效地将毒素偶联到抗体上，获得DAR值均一且高度稳定的偶联产物。

图 6 转肽酶/分选酶（Sortase）及转肽反应

基于氮葡聚糖工程技术的偶联策略

采用基于β-1,4-半乳糖基转移酶（β-1,4-galactosyltransferase，GalT）和α-2，6-唾液酸转移酶（α-2,6-sialyltransferase，SialT）的氮葡聚糖（N-Glycan）工程技术进行偶联。在体外，可利用半乳糖基和唾液酸转移酶的酶促反应引入末端唾液酸。这些唾液酸可经高碘酸盐氧化产生醛基，并进一步通过肟键与Payload共价偶联。该技术的主要优点在于：无论N-Glycan的异质性如何，该策略皆具有较高的可重复性，因此可用于含各种N-Glycan的任何mAb与Payload的偶联。

爱必信ADC毒素抗体定点偶联试剂盒（abs580253）操作简便，无需抗体工程化等复杂操作，可快速实现单抗的定点偶联。偶联产物均一、稳定。适用于偶联阶段定点偶联，ADC早期偶联研究。

偶联原理：

（1）抗体叠氮化修饰

首先使用糖苷酶（EndoS）暴露单抗恒定区的保守N糖链上的乙酰葡糖糖胺（蓝色方块），然后使用牛半乳糖转移酶突变体（b.GalT^Y298L）将带有叠氮官能团的乙酰半乳糖胺（黄色方块-N3）连在乙酰葡萄糖胺上。

（2）毒素分子连接

随后可使用无铜催化的炔叠氮化物环加成反应（如SPAAC）将生物素、荧光素或毒素分子（如：endo-BCN-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，abs823512）等连在单抗上。

验证数据

ADC工艺开发、CMC和临床前研究

ADC 药物生产涵盖抗体、细胞du药物/连接子、ADC 原料药及制剂三大模块，各模块均需工艺开发与验证，且要制定工程细胞、起始原料及试剂的质控要求。偶联生产用中间体质控灵活，考验工艺与质控体系研发能力，抗体和细胞毒素性质差异使生产挑战大，工艺表征研究对后续批次意义重大。CMC 研究有 4 部分：1. 抗体；2. 载荷-连接子中间体；3. ADC原料药；4. 制剂部分。同时，还应引入药物抗体比率、连接位点、药物负载分布等特殊质控指标，并控制游离载荷和抗体，研究其对结合效力及血浆稳定性的影响。

由于ADC的复杂性和多样性，以及生物样本中释放的细胞du药物含量较低等原因，对药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 表征提出了du特的挑战。此外，在安全性评价中生物分析方法的选择和检测的准确性也是考量要素。

在药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 研究中， 我们提供全面的实验试剂和技术服务支持（液相芯片(Luminex)检测服务、超敏电化学发光（MSD）、DSP空间多组学），产品和服务覆盖了从基础细胞实验到复杂组织分析的全流程，为药理学和毒理学研究提供一站式解决方案。

参考文献

[1] Kyoji Tsuchikama, et al. Antibody-drug conjugates: recent advances in conjugation and linker chemistries. Protein Cell. 2018Jan;9(1):33-46

[2] Joshua Z Drago, et al. Unlocking the potential of antibody-drug conjugates for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jun;18(6):327-344.

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