一、实验准备

1、hPSC诱导分化肺类器官试剂盒（abs90128-1kit）

产品组成：

2、辅助试剂

3、实验耗材

 二、诱导流程图

三、培养方法

1、hPSC分化为内胚层细胞（DE） （按6孔板1孔算）
（1）基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合，铺板，备用。
（2）当hiPSC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗hiPSC，吸去PBS。
（3）加入1mL含Y-27632（10 μM）的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO₂细胞培养箱中20 min，使其解离成单细胞。
（4）20 min后，将hESC/iPSC 培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
（5）从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。
（6）离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的Advance 人多能干细胞培养基（含10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
（7）使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将密度为2.0 *10⁵个细胞/mL的细胞接种到步骤1制备的6孔基质胶包被的板上，在6孔板中每孔最终体积为2 mL，将孔板转移到37℃、5%CO₂细胞培养箱中孵育24h。
（8）24h后（第1天）吸去培养基，并加入1.97mL基础培养基1+10μL补充剂A+20μL补充剂B。
（9）在第2天和第3天，吸去培养基，加入1.98mL基础培养基1+20μL补充剂B，开始分化为内胚层细胞。

2、DE诱导分化为前肠内胚层细胞(AFE)
（1）第4天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1x室温PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗培养物，然后从孔中移除PBS，每孔加入2 mL基础培养基2。
（2）将培养板放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养，每24h更换一次培养基，连续培养3天。

3、AFE诱导分化为肺祖细胞(LPC)（以12孔板4个孔为例）
（1）29.92mL基础培养基3+80μL补充剂C配成LPC诱导培养基
（2）第7天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1x室温PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗培养物，吸去PBS。
（3）每孔加入1mL含Y-27632（10 μM）的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO₂细胞培养箱中孵育10 min。
（4）10 min后每孔加入1mL DMEM/F12（含10μM Y-27632），轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。
（5）将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
（6）仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的LPC诱导培养基（含10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
（7）使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将密度为2.0 x10⁵个细胞/mL的细胞接种到提前制备的12孔基质胶包被的板上，在12孔板中每孔培养基最终体积为1 mL。
（8）第二天，更换为不含Y-27632的LPC诱导培养基。每隔一天更换培养基，持续11天。

4、LPC诱导分化为3D肺类器官（以24孔板6个孔为例）
（1）第18天，14.965mL基础培养基4+35μL补充剂D配制成3D类器官诱导培养基
（2）在冰上解冻基质胶，并将移液器吸头提前置于-20℃冰箱中。
（3）吸出LPC诱导培养基，用1 mL1xPBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)洗涤1次。
（4）加入含10μM Y-27632的室温Accutase（0.5 mL/12孔）并在37℃、5% CO₂培养箱中孵育10 min；10 min后每孔加入1mL恢复室温的DMEM/F12（含10μM Y-27632），轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。
（5）将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
（6）仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL 3D类器官诱导培养基重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
（7）使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞。
注意：每个细胞系必须优化细胞数量；在分化的18天内，细胞不应变得过度融合。
（8）室温下以300 g离心5 min，吸出培养基并将细胞重悬于冷基质胶中，对于ESC，每孔4.0*10⁴个细胞添加200μL基质胶，对于iPSC，每孔 8.0*10⁴个细胞，添加200 μL基质胶，将基质胶与细胞一起置于冰上。
（9）将200μL基质胶/细胞混合物按每孔30μL接种到24孔板中。
（10）将板置于37℃、5%CO₂培养箱中20-30分钟使基质胶凝固。
（11）每孔加入700μL 3D类器官诱导培养基，并每隔一天更换培养基，持续6天。
（12）在第23天，14.96mL基础培养基5+40μL补充剂E配制成3D类器官分化培养基，将孔里的培养基更换为700μL恢复室温的3D类器官分化培养基，每隔一天更换培养基，持续6天。
（13）在第29天，199.48mL基础培养基6+520μL补充剂F配制成3D类器官成熟培养基，将孔里的培养基更换为700μL恢复室温的3D类器官成熟培养基，每隔一天更换培养基，进行长期培养。

5、3D肺类器官传代
（1）取出冷冻的基质胶置于4℃解冻，并提前将枪头放置在-20℃预冷1h；
（2）吸除培养基，加入1mL预冷的类器官传代消化液，静置1min；
（3）使用1mL移液枪，吹打孔中混合物40-50次，注意：不要产生气泡；
（4）每孔加入1mL预冷的PBS，将混合物转移到15mL离心管中；
（5）用1mL预冷的PBS清洗培养板，并将该清洗液加入上一步的离心管中，并补充预冷的PBS，使离心管中的终体积为12mL；300g离心5min，去上清；
（6）用预冷枪头按每孔30μL的量在离心管中加入适量的基质胶，吹打5-8次，均匀混合单细胞-基质胶，注意吹打过程中避免产生气泡；
（7）将提前放在培养箱中的24孔板取出，在孔中心位置加入30μL胶滴，缓慢打入混合液时，逐渐向上移动枪头，使细胞均匀分布在胶中；
（8）将培养板放在培养箱中，20-30min，使胶滴凝固；
（9）小心沿孔壁加入700μL恢复室温的3D类器官成熟培养基，每隔1天换液一次（可周一、周三、周五换液，周五可添加至800μL，周六、周日不换液），注意：不要碰到胶滴，将孔板放到培养箱中，继续培养。