样本处理：

加入抑制剂：在裂解缓冲液（lysis buffer）中必须加入蛋白酶抑制剂和适量的磷酸酶抑制剂，以抑制组织或细胞裂解过程中释放的内源性蛋白磷酸酶，防止磷酸化蛋白去磷酸化，从而维持蛋白质的磷酸化状态。

确保裂解：建议使用裂解液裂解结合超声处理，确保细胞充分裂解并剪切染色质DNA。超声处理时应保持低温，避免蛋白降解。

新鲜样本：使用新鲜制备的样本，避免反复冻融，以减少磷酸基团的降解。

抗体孵育：

低温孵育：一抗孵育最好在4°C下进行，并过夜孵育，以确保抗体与目的蛋白充分结合。低温有助于维持抗体与抗原的物理吸附，防止高温下抗原脱落。

稀释液选择：根据产品说明书推荐的稀释液稀释抗体，通常建议使用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST稀释液，而非含脱脂牛奶的TBST，因为脱脂牛奶中可能含有磷酸化蛋白，影响实验结果。

洗涤条件：

洗涤液选择：推荐使用TBST作为洗涤液，相对于PBST，TBST能提供更强的信号。

洗涤次数和时间：洗涤次数和时间需要优化，以避免信号减弱或背景增加。通常建议一抗和二抗孵育后，用TBST洗膜3次，每次5分钟。

封闭条件：

封闭剂选择：虽然网络上流传磷酸化抗体不适于用牛奶封闭的说法，但使用实验级脱脂牛奶进行室温封闭1小时是有效的，且有助于降低非特异性结合。

封闭时间：避免膜封闭时间过长，以免掩盖抗原表位，阻止抗体结合。

对照设置：

阳性对照：设置合适的阳性对照，以确认抗体检测到的特异性信号。

总蛋白和内参对照：除了检测磷酸化蛋白外，还应检测该蛋白的总表达量，以及使用普通内参作为体系对照，保证上样量一致。

实验环境：

低温环境：在整个实验过程中，除超声处理外，应保持低温环境，以防止磷酸化蛋白在室温下被蛋白磷酸酶降解。

结果分析：

分子量比对：在压片后，根据marker比对条带的分子量，确认检测到的条带是否正确。

曝光时间：优化曝光或压片时间，以避免背景过深或条带过浅。

抗体质量：

选择高质量抗体：确保使用的磷酸化抗体质量可靠，并严格按照抗体说明书进行操作。