IPS诱导肠类器官培养分为三大阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。

内胚层分化及中/后肠模式化诱导

一、前期准备

1、试剂与设备

   - 细胞：H1/H9 hESC或患者来源iPSCs。  

   - 培养基：人多能干细胞培养基(abs9403)、RPMI 1640(abs9484)。

   - 消化液：人多能干细胞消化液(abs9409)

   - 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)(abs9295)、双抗(abs9244)

   - 生长因子：Activin A(100ng/mL)(abs05801)、FGF4(500ng/mL)(abs06269)、WNT3a(500ng/mL)(abs05632)。  

   - 基质胶：即用型基质胶（培养板包被）(abs9410)、类器官专用基质胶(abs9495)。

   - 血清：透析胎牛血清(abs945)

   - 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。 

2、试剂配制

   - 内胚层分化培养基：  

     - Day1：RPMI 1640+L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)+双抗(1%)+Activin A(100ng/mL)。  

     - Day2：Day1配方+透析胎牛血清(0.2%)。  

     - Day3：Day1配方+透析胎牛血清(2%)。  

   - 中/后肠分化培养基：

     -RPMI 1640+透析胎牛血清(2%)+FGF4(500ng/mL)+WNT3a(500ng/mL)。

二、hPSCs传代与铺板

1、细胞传代（耗时2h）  

   - 使用人多能干细胞消化液消化hPSCs至边缘卷起。  

   - 用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，反复吹打至1-2mm大小细胞团。  

   - 按1:6比例接种至Matrigel包被的24孔板（每孔约5000个细胞团）。  

   - 轻敲培养板使细胞均匀分布，37°C过夜培养。  

2、细胞扩增至85-90%融合（3-4天）  

   - 每日更换人多能干细胞培养基，观察细胞密度。  

   - 关键：密度过高（自发分化）或过低（分化效率低）需重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

1、Day1：吸除人多能干细胞培养基，加入Day1内胚层培养基（无血清），培养24h。  

2、Day2：更换为Day2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），培养24h。  

3、Day3：更换为Day3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），培养24h。  

4、验证分化效率（可选）：  

   - 免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞（效率应达85-90%）。

四、中/后肠模式化（3-4天）

1、诱导球状体形成

   -吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基，每日更换。  

   -48h后：立体显微镜下观察上皮增厚，72-96h球状体(spheroids)脱离单层细胞。  

2、收集球状体

   -用200μL枪头收集游离球状体，每管约50个，置于冰上备用。

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