聚合酶链反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)由Kary Mullis博士于20世纪80年代开发。该技术因其识别特定DNA序列并快速准确地合成大量副本的能力而被比作“分子复印机"。目前开发了各种基于原始PCR方法的衍生技术。实时PCR，也称为定量PCR(qPCR)，将PCR放大和检测结合在一步中。另一种称为逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的技术使用RNA作为核酸起始模板。

● PCR：包含DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs的反应混合物的重复加热和冷却循环。[1]每个循环都会使DNA的数量增加一倍左右，因为在下一个循环中，一条新的DNA链会成为复制的模板。这导致DNA数量呈指数增长。

图1 PCR的第一个循环[1]

● RT-PCR(Reverse transcription PCR)：反转录PCR可以使用RNA作为模板，生成互补DNA(cDNA)。使用逆转录酶可生成cDNA的单链拷贝。这可以使用与RNA的PolyA尾部相结合的寡聚体(dT)引物，或使用随机六聚体（六至九个碱基长的引物，在RNA转录物的多个点上进行结合）来完成。一般来说，两种引物的混合被认为是合适的，因为它能够放大PolyA尾RNA（主要是mRNA）和不含PolyA的RNA（tRNA、rRNA等）。然后再用DNA聚合酶进行扩增，生成双链cDNA，送入基于PCR的标准扩增过程。

● qPCR(Quantitative PCR)：是定量实时PCR，即实时对DNA进行PCR扩增，通过荧光探针（最常见的是插层染料或水解探针）进行测量，从而对PCR产物进行定量。用于检测病原体的存在，并确定相关DNA序列的拷贝数。SYBR Green I是zui常用的DNA结合荧光染料，当与双链DNA结合时会发出荧光，荧光强度与PCR产物的浓度成正比增长。

与标准PCR相比，定量PCR的优势在于无需琼脂糖凝胶就能实时观察到哪些反应起了作用。它还能进行真正的定量分析。

● RT-qPCR(Reverse Transcription Quantitative real-time PCR)：这是一种将RT-PCR与qPCR相结合的技术，用于反转录定量实时PCR。通过在qPCR反应中使用cDNA来测量RNA水平，从而快速检测基因表达的变化。

RT-qPCR可用于研究用抑制剂、刺激剂、小干扰RNA(siRNA)或基因敲除模型等处理模型系统时基因表达的变化。这项技术还经常用于检测RNA-Seq实验之前（作为质量控制）和之后（确认变化）的表达变化。

RT-qPCR样品制备的最后一步是产生cDNA。除了考虑引物外，cDNA的生成可以是qPCR实验（称为一步RT-qPCR）的一部分，也可以与qPCR（两步RT-qPCR）分开生成（图3）。

图2 RT-PCR, qPCR and RT-qPCR示意图 [2]

图3 一步法RT-qPC和两步法RT-qPCR[2]

● ddPCR(Droplet-based Digital PCR)：样本穿过微流控芯片形成一种分段流，其中样本被分成数万个液滴可以充当PCR反应室，这些液滴被不混溶的液体（例如矿物油）分离，形成乳液[3]。将乳液收集在小瓶中，进行PCR，随后通过流式细胞仪处理样本，以计数PCR阳性的液滴数量。或将乳液送入塑料芯片中，形成单层液滴，进行热循环并捕获并评估液滴的荧光图像[4]。与qPCR相比，ddPCR具有精确度更高、绝对定量变异系数更低的优点[5]。PCR多重化通常通过基于探针的荧光进行，每个DNA/RNA具有不同的激发颜色。也用于生成单细胞RNA测序的库。

图4 ddPCR示意图[6]

参考文献：

[1] Jalali M, Zaborowska J, Jalali M. The polymerase chain reaction: PCR, qPCR, and RT-PCR[M]//Basic science methods for clinical researchers. Academic Press, 2017: 1-18.

[2] Zhang H, Tang K, Wang B, Duan CG, Lang Z, Zhu JK. Protocol: a beginner's guide to the analysis of RNA-directed DNA methylation in plants. Plant Methods. 2014 Jun 14;10:18. doi: 10.1186/1746-4811-10-18. PMID: 24955108; PMCID: PMC4065543.

[3] Schiffman M, Bauer H, Lorincz A et al. Comparison of Southern blot hybridization and polymerase chain reaction methods for the detection of human papillomavirus DNA. J. Clin. Microbiol.29(3), 573–577 (1991).

[4] Madic J, Zocevic A, Senlis V et al. Three-color crystal digital PCR. Biomol. Detect. Quant. 10, 34–46 (2016).

[5] Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat. Methods 10, 1003 (2013).

[6] Hwang B, Lee JH, Bang D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 2018 Aug 7;50(8):1-14. doi: 10.1038/s12276-018-0071-8. Erratum in: Exp Mol Med. 2021 May;53(5):1005. doi: 10.1038/s12276-021-00615-w. PMID: 30089861; PMCID: PMC6082860.

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