相信大家看着这个标题，心情都是沉重的，尤其是对一些难养的类器官，好不容易养起来了，结果传完代长不起来了，这是啥情况啊？今天咱们从下面3个层面分析类器官传代失败原因。

影响类器官传代因素

一、类器官传代手法

影响类器官传代最主要的因素是传代手法。尤其是一些娇贵的类器官，就像温室的花朵，经不起任何“风雨"，比如基质胶冷化条件（温度及时长）、离心条件（温度、转速、时长）、弃除上清时的类器官丢失、消化条件（温度、时长）、吹打力度对于它们来说就是“西天取经路上的九九八十一难"。

（1）基质胶冷化温度、时长

类器官传代时，我们需要把5-10孔（24孔板为例）的基质胶和类器官混悬物用类器官传代缓冲液(abs9730)吹散后收集到15mL离心管，并用类器官传代缓冲液定容到14mL。接下来冷化基质胶，可以选择多种方式比如，4℃预冷30min； 0℃预冷30min；-20℃预冷5min。通常情况下，多数类器官都是可以采取上述三种方式，但少数类器官对温度或时长过于敏感。对温度过于敏感的类器官建议采用4℃预冷30min或0℃预冷30min；对时长过于敏感的类器官建议采用-20℃预冷5min。

（2）离心温度、转速、时长

离心对类器官可能造成的损伤主要包括：

A、机械应力损伤：离心过程中产生的机械应力可能会对类器官细胞造成破坏。这种损伤可能包括细胞膜的破裂、细胞内部结构的损伤，以及细胞功能的丧失。

B、温度影响：离心时的温度对类器官的保存状态有重要影响。如果离心温度过高，可能会导致基质胶固化，影响类器官的分离和保存。因此，建议在4°C的低温条件下进行离心，以避免热损伤。

基质胶冷化后在进行离心分层时，建议选用水平角离心机，转速控制200g-300g，温度设为4℃，时长控制在5min以内。

（3）弃除上清时的类器官丢失

分层现象（缓冲液、基质胶、类器官沉淀）

离心后的类器官正常是分层三层：缓冲液、基质胶、类器官沉淀，正常我们是保留类器官沉淀层，上面的缓冲液和基质胶去掉。但如果我们原代培养的类器官数量就很少，分层后的类器官沉淀层也会很少，这种情况下，我们不仅要保留类器官沉淀，还要保留基质胶的下2/3，甚至基质胶全层，以减少类器官的遗失（基质胶层会残留类器官）。点胶时保证新胶量是残留胶的1.5倍体积以上，以保证基质胶的贴壁粘附性。

当然，有时候离心后的类器官离心后也会出现两层：缓冲液、基质胶类器官混悬液。这种情况，建议保留基质胶类器官混悬液下2/3，甚至基质胶全层，以减少类器官的遗失（基质胶层会残留类器官）。点胶时保证新胶量是残留胶的1.5倍体积以上，以保证基质胶的贴壁粘附性。

（4）消化温度、时长

上述离心后的类器官悬液在进行消化传代时，那么要特别注意消化温度、时长的控制。消化过度对类器官造成的损伤体现在两个方面：

A、细胞膜损伤和细胞死亡：消化过强可能会破坏细胞膜，导致细胞内容物释放到培养基中，引起细胞死亡。

B、细胞凋亡增加：胰酶消化时间过长，可能会增加细胞的凋亡率。因为过度的消化可能对细胞膜造成损伤，影响细胞表面受体蛋白的功能性和完整性。

虽然消化酶在37℃下活性最好，但消化效力太强对类器官不一定是好事，通常我们在室温超净台内进行类器官消化就可以了，能更好地把控消化程度，及时根据镜检结果终止消化进程。同时，消化时长建议2-3min即可（消化时间越长，可能会增加酶对类器官造成的损伤）。

（5）吹打力度

枪头吹打在类器官培养中产生的主要有两种力：机械损伤和剪切力。

A、机械损伤：这主要是指枪头刮擦、细胞间相互碰撞等导致的细胞损伤。为了减少这部分损伤，需要尽量减小吹打力度，只要保证能够吹下吹散细胞就行。枪头与细胞层接触甚至研磨会导致细胞直接死亡，因此在操作时需要控制枪头与培养板底的间距，避免直接接触。

B、剪切力：剪切力是指物体横截面受到外力影响，沿外力方向相对移动的现象，这个外力就叫做剪切力。 在细胞培养基里，如果有很多气泡，细胞处在气泡与培养基之间，当气泡破碎时，细胞瞬间会受到强大的剪切力影响从而导致细胞碎裂。

如果选择机械吹打传代方式，吹打的力度和次数对类器官活性影响很大。如果用1mL枪头吹打，操作一定要轻柔，避免液流剪切力多类器官造成割伤，也可使用无菌巴适吸管代替枪头，对类器官伤害小。同时吹打次数控制在30次以内，可随时镜下观察，一旦类器官从基质胶中解离出来，并且有较多细胞团块，即可停止吹打。因此， 在进行类器官吹打时，需要特别注意控制力度和技巧，以减少对细胞的损伤。

二、类器官本身

传代后的肺癌类器官一周内基本不长

（1）类器官活性强度

不同种类的类器官活性差异很大，活性比较强的类器官有子宫内膜癌类器官、肠癌类器官，培养相对容易很多，连续传代甚至可达30多代。然而有些类器官本身活性不足，比如甲状腺癌类器官，只能维持原代，传代后基本不长。除此以外，一致认为难养的类器官还有肝癌类器官、前列腺癌类器官。

（2）类器官数量

如果在原代培养中类器官数量稀少，例如24孔板，每孔点50uL基质胶细胞团混悬物，长成的类器官数量低于20个，通常是类器官数量较少的情况。此时，如果传代操作不当，出现类器官大量丢失，就会导致传下里的细胞团密度过稀，缺少旁分泌信号调控，类器官增殖困难，出现长不大现象。因此，原代类器官数量多少也直接影响是否能顺利传代。

三、营养体系

（1）培养基

完quan培养基（添加因子）建议分装储存于-20℃，有效期长达1年；保存在4℃，建议2周内用完，超过1个月，因子活性会逐渐下降。

4℃储存太久（一个月以上）会导致培养基的效能下降，而效能下降又是怎样影响类器官传代效果的呢？

举个例子：消化传代前后使用的是同一瓶培养基，原代养得可以，传代不行了。大家在推断原因时可能会首先排除培养基问题，因为消化传代前后使用的是同一瓶培养基，如果是培养基的问题，原代也养不好才对，而结果是原代养得好，传代不好了。这里其实有大家想不到的因素存在。大家都知道类器官通常传到一定代次会出现类器官增殖变缓（比如数量减少和体积缩小），就传不下去了。因为类器官培养的成体干细胞或肿瘤干细胞，在经历多次传代后，干性（自我更新和分化能力）都会逐代降低，最后就传不下去。在类器官原代培养中，肿瘤干或成体干细胞干性很强，即便使用4℃储存过久的培养基，依然可以增殖起来。而当不断传代后，肿瘤干或成体干细胞干性逐渐下降，对培养基的因子活性需求就会提高，再使用4℃储存过久的培养基就会难把类器官扩增起来。

（2）类器官传代消化液

消化液对类器官传代的影响主要体现在2个方面：

A、传代消化液是否恰当，不合适的酶会造成类器官损伤。

B、传代消化液建议分装保存在-20℃，有效期长达1年，保存在4℃下，建议2周内用完，超过1个月，酶活会逐渐下降。

首先，消化酶的消化力度还取决于酶的种类。我们尝试过胰酶进行类器官消化，发现胰酶对类器官的消化损伤比较大，不适合作为类器官传代消化酶。所以，建议大家使用专用的类器官传代消化液(abs9520)，其采用的多种温和消化酶对类器官消化比较温和。其次，消化液如果长时间存放于4℃，酶活会逐渐降低，消化类器官需要时间会想要增加，而增加消化时间，把控时长不当，容易导致消化过度，使类器官活性受损。

（3）基质胶

基质胶建议分装保存在-20℃，有效期长达1年，保存在4℃下，建议2周内用完，超过1个月，基质胶的粘附性和因子活性会逐渐下降。

基质胶的作用有两个，其一是起支架作用，维持类器官的椭球形态，其二是含有丰富的因子种类，对类器官的生长有促进作用。当基质胶存4℃储存时间过久，基质胶的粘附性和因子活性均会大大降低，此时的基质胶类器官穹顶结构容易脱离培养板底面而漂浮，同时也难以维持类器官增殖需求。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎一起交流哦！

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