RNA Pull Down技术是一种生物实验技术，它被广泛应用于研究RNA与蛋白质之间的相互作用以及寻找可能的未知RNA结合蛋白。该技术的基本原理是利用带标签的RNA探针与目标蛋白质进行体外或体内结合，然后通过亲和分离或免疫共沉淀等方法将结合的复合物分离出来，最后对分离出来的复合物进行检测和分析。 

一、RNA Pull Down技术概述

RNA Pull Down技术是一种研究RNA与蛋白质之间相互作用的技术。它通常利用带标签的RNA探针与目标蛋白质进行体外或体内结合，然后通过亲和分离或免疫共沉淀等方法将结合的复合物分离出来，最后对分离出来的复合物进行检测和分析。该技术的优点在于可以快速、有效地筛选和鉴定与特定RNA结合的蛋白质，同时也可以检测和分析RNA的结构和功能。

二、RNA Pull Down技术实验步骤

1、设计并合成带标签的RNA探针

根据实验目的设计并合成带标签的RNA探针，标签可以是生物素、荧光染料等。探针可以是特定基因的正义链或反义链，也可以是特定转录本的全部序列或部分序列。在设计探针时，需要注意以下几点：

1）确保探针的特异性：选择的探针应该与目标RNA具有高度特异性，以避免与其他RNA或蛋白质的非特异性结合。

2）考虑探针的长度和结构：探针的长度和结构可以影响其与目标RNA的亲和力。一般来说，较短的探针与目标RNA的亲和力较低，但特异性较高；而较长的探针则具有更高的亲和力，但特异性可能较低。需要根据实验具体情况选择合适的探针长度和结构。

3）考虑探针的修饰：探针可以修饰以增加其与目标RNA的亲和力。例如，可以添加聚嘌呤或聚嘧啶序列以增加与目标RNA的结合能力。但需要注意的是，修饰可能影响探针的特异性。

2、准备细胞或组织样品

根据实验目的准备适当数量的细胞或组织样品。样品可以是培养细胞、新鲜组织、冷冻组织等。样品处理包括细胞分离、破碎、匀浆等步骤。在准备样品时，需要注意以下几点：

1）确保样品的代表性：选择的样品应该能够代表目标RNA的生物学特性。例如，如果目标RNA在某些细胞或组织中特异性表达，那么应该选择这些细胞或组织作为样品。

2）避免样品污染：在处理样品的过程中，需要注意避免样品污染。例如，使用无菌技术、避免使用含有RNA酶的试剂等。

3、提取总RNA

使用TRIzol或试剂盒等试剂从细胞或组织样品中提取总RNA。这一步是整个实验的关键步骤之一，因为提取的总RNA的质量直接影响到后续实验的结果。提取的总RNA应该进行质量和浓度的检测，以保证其质量和数量符合实验要求。

4、构建RNA-蛋白质复合物

将提取的总RNA与带标签的RNA探针混合，使其在体外形成RNA-蛋白质复合物。这一步中需要注意控制探针与总RNA的比例和反应条件（如温度、时间等），以保证复合物的形成效率和稳定性。在构建复合物时，需要注意以下几点：

1）控制探针与总RNA的比例：探针与总RNA的比例可以影响复合物的形成效率。一般来说，探针与总RNA的比例应该控制在1:1至1:5之间。

2）控制反应条件：反应条件如温度、时间等可以影响复合物的稳定性。需要根据实验具体情况选择合适的反应条件。

5、亲和分离

使用磁珠或色谱柱等亲和分离介质将复合物从反应液中分离出来。这一步中需要选择合适的介质和洗脱条件，以保证复合物的分离效率和纯度。在亲和分离时，需要注意以下几点：

1）选择合适的亲和分离介质：根据实验需求选择合适的磁珠或色谱柱等亲和分离介质。

2）控制洗脱条件：洗脱条件可以影响复合物的分离效率和纯度。需要根据实验具体情况选择合适的洗脱条件。例如，可以控制洗脱液的pH、离子强度等条件以获得最佳的分离效果。

6、蛋白质鉴定

将分离出来的复合物进行蛋白质鉴定（如Western blot、质谱等）。这一步中需要选择合适的鉴定方法和抗体，以便于鉴定出与特定RNA结合的蛋白质及其相对丰度。同时还需要对鉴定的结果进行统计和分析，以评估实验的可靠性和可信度。在RNA pull down实验中进行蛋白质鉴定时，需要注意以下几点：

1）鉴定方法的选择：根据实验需求和条件选择适合的蛋白质鉴定方法。常用的方法包括Western blot、质谱等。

2）蛋白质的特异性：鉴定蛋白质时需要确保所鉴定的蛋白质具有特异性，即所得到的蛋白质条带或峰是否与预期的蛋白质一致，排除其他蛋白质的干扰。

3）蛋白质的丰度：鉴定蛋白质时需要了解所鉴定蛋白质的丰度，即其在样本中的相对含量。这可以通过比较不同样本中蛋白质的条带强度或峰高来确定。

4）蛋白质修饰：鉴定蛋白质时需要注意蛋白质是否发生修饰，如磷酸化、糖基化等。这些修饰可能会影响蛋白质的功能和稳定性。

5）蛋白质相互作用：鉴定蛋白质时需要考虑所鉴定蛋白质与其他蛋白质的相互作用。这些相互作用可能影响蛋白质的功能和稳定性，因此需要进行相关的实验验证。

三、RNA Pull Down技术的常见问题解析

1、RNA结合蛋白没有结合可能原因：

靶蛋白量不足；

缓冲体系不对；

RNA探针和蛋白的亲和力本来就低。

解决办法：增加上样蛋白量；应用低盐体系；加入交联试剂。

2、RNA降解可能原因：

无核酸酶的环境被破坏，比如RNA提取过程中的试剂及材料等；

体外转录的RNA探针降解等。

解决办法：清洗和使用新开的离心管和试剂等；RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度。

3、如何预防RNA降解

实验使用的所有试剂耗材需经过去RNA酶处理。

4、RNA pull-down一定要体外转录合成RNA探针吗？不能基因合成吗？

一般我们认为的基因合成是合成DNA双链，体外转录只是获得RNA的一种方式，相比化学合成纯度更高。所以pull-down实验一般是体外转录得到目的RNA。

5、RNA在转录出来后，其OD一般都不高，可以使用吗？咋定量呢？

一般会进行电泳检测（DNA电泳方式一样），可以根据marker浓度来判断RNA的浓度。Pull-down实验不需要精确的定量，都会加入过量的探针。

6、关于样本处理：细胞裂解物裂解的时候要不要加蛋白酶抑制剂还有RNA酶抑制剂这些处理？细胞裂解物提取蛋白是要怎么处理？还是就是裂解细胞就行了？

在处理细胞裂解物时，为了保护目标RNA和蛋白质，防止降解或修饰，可以加入蛋白酶抑制剂和RNA酶抑制剂。在提取细胞裂解物中的蛋白质时，可以进行简单的离心或过滤来收集上清液中的蛋白质。或者使用更复杂的蛋白质分离方法，如色谱、质谱等，以获得更纯的蛋白质样品。

总之，针对RNA Pull Down实验中可能出现的问题，需要仔细分析并采取相应的措施进行解决。同时，在实验过程中注意规范操作，提高实验的可重复性和可靠性。

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