● 什么是蛋白磷酸化？

蛋白磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)，指的是在蛋白质的特定氨基酸残基上添加磷酸基团的过程。这一过程通常由一类称为蛋白激酶的酶催化，而去除磷酸基团则由磷酸酶催化。磷酸化主要发生在丝氨酸(Serine)、苏氨酸(Threonine)和酪氨酸(Tyrosine)残基上。

图1 蛋白磷酸化示意图

● 常见的蛋白激酶

国际生物化学联合会根据受体氨基酸的特异性，将蛋白激酶分为以下几类：

1）以蛋白乙醇基作为受体的磷酸转移酶称为蛋白丝氨酸或苏氨酸激酶；

2）以苯基为磷酸受体的磷酸转移酶称为蛋白酪氨酸激酶；

3）以His，Arg或Lys为受体的磷酸转移酶称蛋白His激酶；

4）以Cys残基作为受体的磷酸转移酶称蛋白Cys激酶；

5）以乙酰基作为受体的磷酸转移酶称天冬或谷氨酰胺激酶。

前两类酶最常见，许多蛋白丝/苏氨酸或酪氨酸激酶已被纯化。

● 研究蛋白磷酸化的意义？

1）细胞信号传导和调控：蛋白磷酸化在细胞内的信号传导中起着关键作用。通过磷酸化修饰，蛋白质能够被激活或抑制，从而参与细胞内多种信号通路的调控，包括细胞增殖、凋亡、分化等。这种修饰方式在细胞信号传导、基因表达调控、细胞周期调控等生物学过程中发挥着重要作用；

2）细胞周期和增殖：蛋白质磷酸化在细胞周期的各个阶段中发挥重要作用。磷酸化修饰可以调控细胞周期蛋白的活性，控制细胞的有序分裂和增殖，维持细胞的正常功能；

3）疾病发生和治疗：许多疾病的发生与蛋白质磷酸化的异常有关。研究蛋白质磷酸化的变化可以帮助我们理解疾病的发病机制，发现潜在的治疗靶点，并开发新的药物治疗策略。异常的蛋白磷酸化与许多疾病有关，特别是癌症。例如，某些致癌基因编码的蛋白激酶可能会导致不适当的磷酸化，进而促进肿瘤发生和发展；

4）药物开发与筛选：通过分析蛋白质磷酸化的变化，可以发现新的药物靶点和信号通路，指导药物的设计和开发。同时，蛋白质磷酸化分析还可以用于药物筛选，评估药物对特定磷酸化位点的调控效果；

5）个体化医学：蛋白质磷酸化分析可以为个体化医学提供重要的指导。通过检测磷酸化位点的状态，可以预测患者对特定治疗的响应，为临床治疗决策提供依据；

6）生物标志物鉴定：研究人员通过分析蛋白质磷酸化的变化，发现了许多与疾病相关的生物标志物。这些生物标志物可以用于疾病早期诊断、预后评估和治疗监测等；

7）蛋白质功能和稳定性：磷酸化作用可以改变蛋白质的构象，从而改变其活性和/或稳定性。例如，磷酸化可以通过改变酶的活性状态来调节酶的活性。另外，磷酸化还可以通过改变蛋白质的降解速率来调控蛋白质的稳定性；

8）蛋白质相互作用：磷酸化可以改变蛋白质或蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用。例如，磷酸化可以介导蛋白质与配体的结合，从而影响信号转导通路的激活。此外，磷酸化还可以改变蛋白质与其他蛋白质之间的亲和力或抗体性，从而影响细胞中的复杂网络互作。

● 常用的蛋白质磷酸化检测方法有哪些？

免疫印迹(Western Blotting)：这是一种常用的蛋白质检测技术，可用于检测蛋白质磷酸化水平。关键步骤包括蛋白质提取、蛋白质分离和转移、抗体识别和信号检测。通过选择特异性的磷酸化抗体，可以准确检测目标蛋白的磷酸化水平。

质谱分析法(Mass Spectrometry)：质谱分析是一种高灵敏度和高分辨率的蛋白质分析技术，可用于检测蛋白质磷酸化位点和定量磷酸化水平。常用的方法包括液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)和磷酸化肽富集等。通过分析质谱数据，可以鉴定和定量磷酸化肽，并确定磷酸化位点。

酶联免疫吸附分析(ELISA)：可以利用磷酸化特异性抗体对蛋白质样本中的磷酸化水平进行定量分析。这种微孔板形式的分析一般是利用目的蛋白特异的捕获抗体，和磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。

放射性同位素标记法：通过使用32P同位素放射性标记磷酸盐作为磷酸基团供体，经过磷酸化酶促反应，带有32P同位素放射性标记的磷酸基团则转移到相应的反应蛋白上，通过凝胶电泳分离，可以用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。

免疫荧光和流式细胞术等也是蛋白质磷酸化研究的工具。除此以外，今天给大家介绍蛋白质磷酸化检测的新技术——Phos-iso SDS-PAGE

● 什么是Phos-iso SDS-PAGE？

这是一种磷酸亲和电泳技术，可使用常规SDS-PAGE程序分离磷酸化和非磷酸化蛋白质。该技术的核心成分Phos-iso Acrylamide是一种能与磷酸基团特异性结合的双核金属络合物，能够对磷酸化蛋白进行分离和检测。使用过程 中只需在常规SDS-PAGE凝胶中添加Phos-iso Acrylamide和金属离子（Mn2+或Zn2+）即可。在电泳时，固定在凝胶上的Phos-iso复合物可以特异性结合磷酸化蛋白，使得磷酸化蛋白电泳迁移率降低，从而实现磷酸化和非磷酸化蛋白的分离。Phos-iso SDS-PAGE操作简单，能检测不同形式的磷酸化蛋白，不受磷酸化抗体限制，可用于免疫印迹、质谱分析等。

图2 Phos-iso Acrylamide与常规SDS-PAGE的对比示意图

● Phos-iso SDS-PAGE技术优势

1）不需要准备针对磷酸化蛋白的抗体，用总抗体而非抗磷酸化蛋白的抗体即可同时检测磷酸化和非磷酸化的蛋白；

2）可适用于免疫印迹和质谱分析等后续操作；

3）磷酸化位点具有不同数目和位置的磷酸化形式也可以分离。

● 爱必信新品速递——Glass gel 磷酸化蛋白预制胶

Glass gel磷酸化蛋白预制胶（搭配abs9941磷酸化蛋白上样缓冲液(3×)），预先加入了100μmol/L的Phos-iso Acrylamide，打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子，在中心凝胶缓冲液中保存稳定性很好，得到的带条结果也很整齐。分离后，胶可用于考马斯亮蓝染色，免疫印迹和质谱实验。

1）采用自动化的灌胶生产技术，确保了产品质量的高稳定性和重复性；

2）采用玻璃胶板，有效减少蛋白非特异性吸附，使蛋白条带更为敏锐，清晰；

3）胶夹打开极为轻松，只需用刀片在胶夹一侧轻轻划一下即可打开；

4）兼容市场上主流的mini电泳槽，如Bio-Rad、Invitrogen、天能和君意东方等。

图3 磷酸化蛋白电泳实例图

● 常见问题解答

1、条带弯曲

1）样品中含无机盐、表面活性剂、EDTA和钒酸等（可使用TCA沉淀或透析脱盐等处理样品）；

2）样品处理不当，如样品呈粘性酸性等（变性充分，酸性样品溶液呈现黄色-橙色，加入Tris缓冲液中和至蓝紫色即可）；

3）预染Marker条带因含有螯合剂等弯曲导致相邻条带弯曲，空白泳道也会导致条带弯曲（样品与Marker之间使用上样缓冲液间隔）；

4）电泳温度高。

2、无法辨别磷酸化条带

 进行常规SDS-PAGE，验证没有发生条带迁移。

3、如果有对应的磷酸化抗体，磷酸化抗体与Phos-iso SDS-PAGE如何选择？

如果使用磷酸化抗体，需要压完磷酸化抗体后，将抗体从膜上剥离(strip)后再压一次总蛋白抗体。如果使用Phos-iso SDS-PAGE，就能在同一块膜上标记出磷酸化（或几种不同磷酸化形式）与非磷酸化的条带，并可以根据条带灰度比较两者的量。

4、样品必须是纯化的蛋白吗？

不一定，细胞裂解液也可以。纯化的样品进行Phos-iso SDS-PAGE即可进行检测。细胞裂解液，则需要进行Western Blotting。

● 注意事项

1）请勿置于0℃以下。凝胶在0℃以下会冻凝，产生气泡和裂纹，导致凝胶报废；

2）需要进行样品前处理，并且样品品质很大程度影响电泳效果；

3）电泳速度会变慢；

4）无法通过分子量marker推断分子量；

5）转膜需要EDTA处理；

6）普通SDS-PAGE也同时进行；

7）磷酸化蛋白预制胶SDS-PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感，尤其是螯合剂、钒酸、无机、表面活性剂这类物质。强烈建议在磷酸化蛋白预制胶SDS-PAGE之前通过TCA沉淀或渗析法降低杂质含量；

8）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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