一、概述

类器官污染是一个老生常谈的事情，尤其是做胃肠道，组织本身带来的菌群数量非常庞大，一旦消毒不到位，就会导致类器官培养失败。上一期我们学习了类器官污染鉴别与除菌攻略（一），接下来小爱带大家了解类器官原代培养无菌预防及细胞房除菌方案（二）。

二、原代培养无菌预防

1、预防无菌各个环节

2、取样及保存无菌预防

注意无菌性：

1）为预防污染，可在组织保存液(abs9784)中加入1%双抗(abs9244)；

2）组织保存液体积要能浸没整个组织，一般5-10mL；

3）取样瓶要保证无菌，也可以用15mL或50mL无菌离心管当取样管；

4）用酒精棉消毒过的镊子将组织放入含有组织保存液的取样瓶中；

5）手术切除的组织需立即转入含有组织保存液无菌取样瓶中。

保存及运输条件：

1）4℃保存，冰袋运输；

2）越早做，成功率越高，当天做最佳，最晚不超过48h。

3、原代培养试剂抗生素添加指南

备注：

三抗：青霉素10kU/mL，链霉素10mg/mL，两性霉素B25µg/mL。工作浓度稀释100X：青霉素100U/mL，链霉素100ug/mL，两性霉素B 0.25µg/mL。

庆大：10mg/mL。工作浓度200X—20000X：0.5ug/ml-50ug/mL

4、细胞房着装要求

操作细胞培养物前后应洗手。穿戴个人防护设备不仅可保护您免受危险品污染，还可降低皮屑以及衣服上污物和灰尘污染培养物的可能。

正确的穿衣顺序：

1）换专用鞋

2）无尘手套（避免不洁的双手经穿着时沾附于无尘衣上）

3）网帽（带网帽时须确保头发不可暴露于网帽外，之后戴口罩遮住口鼻）

4）无尘服（不要穿棉质衣服(脱落纤维)

5）鞋套

5、超净台试剂布局

适合惯用右手的工作人员的工作台基本布局。惯用左手的工作人员可相应地调整工作台面上物品的摆放位置(图源网络)

超净工作台或安全柜里的物品摆放一般遵循以下右手试用习惯，并可根据特殊实验中增加物品进行相应的改动。

1）在工作台中部开阔区域放置细胞培养容器；

2）移液器置于右前方易于取用的地方；

3）试剂和培养基置于右后方，便于吸取；

4）试管架置于中后部，用于固定其他试剂；

5）小型容器置于左后部，用于盛放废液。

6、人为操作技巧

1）小心取用无菌实验物品，勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，也不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝下放置桌面。

2）每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同也不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75%酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10min以上后，再进行下一个细胞株之操作。

3）离心管、冻存管等容器需用抗酒精的标记笔标示内容物名称、操作日期、操作人员姓名。若是细胞传代培养，更需注明目前的代数，以及这是同一代中的第几盘。

三、细胞房除菌方案

细胞房主要做好清洁和消毒工作，小爱汇总了目前细胞房常用的消毒试剂种类及作用原理，供大家了解。

除菌剂种类及作用原理

1、仪器设备、物体表面除菌方案

适宜微生物增殖的主要条件是温暖潮湿的地方，比如培养箱、水盘、水浴锅等，常用的除菌剂如下所示：

培养箱除菌剂(abs9372-480mL)

培养箱除菌剂特点：

广谱高效：专门用于清除CO₂培养箱内的细菌、真菌及支原体等微生物污染；

安全性高：无刺激，无腐蚀，不挥发；

使用方便：直接喷洒即可，省时省力。

用法：

1、移除细胞后，直接对细胞培养箱的隔板、内壁喷洒适量，也可倒出少许，将脱脂棉球浸泡后擦拭使用；

2、建议一周处理一次，配合培养箱水盘除菌剂使用效果更佳。遇污染爆发时期，如梅雨季节等，可适当增加用量。

细胞房除菌剂(abs9373-480mL)

细胞房除菌剂特点：

具有很强的抑菌功能，可用于细胞房的污染控制，通过清除细胞房内细菌、真菌及其孢子，可有效防止细胞的污染，从而减少由于细胞污染带来的人力、财力、时间方面的浪费。

用法：

1．直接对细胞房的死角、墙面、空间进行喷洒，也可倒出少许，将脱脂棉球浸泡后擦拭使用。 建议一周处理一次，配合紫外线使用效果更佳。
2．建议每立方米(m³)使用量为5-8mL，如10m²、高3m的房间推荐用量为150mL。遇污染爆发时期，如梅雨季节等，可适当增加用量。若室内墙壁上有霉菌生长，可喷洒于墙壁表面，或者用浸泡后的棉球擦拭。

水盘抑菌剂(abs9374-20mL)

水盘抑菌剂特点：

用来消毒培养箱中的水盘，可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；无毒；对不锈钢无腐蚀性；不挥发。

用法：

1）建议每周进行一次系统地清洁和消毒培养箱水盘。

2）稀释100倍即可使用，即将1升水中加入10mL的水盘抑菌剂。

水浴锅抑菌剂(abs9371-100mL)

水浴锅抑菌剂特点：

用来消毒水浴锅，可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。

用法：

1）建议每周进行一次系统地清洁和消毒水浴锅。

2）稀释500倍即可使用，即将1升水中加入2mL的水浴锅防菌剂。

2、细胞房空气消毒方法

空气污染不容小觑，气溶胶污染也是细胞房常见的污染途径，小爱整理了常见的空气消毒方法如下：

3、细胞房地面消毒方法

地面是细胞房最常忽略的地方，通常，脚底带来的微生物污染也是导致细胞房污染爆发的关键因素之一，小爱整理了常用的地面清洁剂，供大家参考。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎一起交流哦！

注：文中部分图源于网络，仅供学习参考用。

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