一、概述

类器官污染是一个老生常谈的事情，尤其是做胃肠道，组织本身带来的菌群数量非常庞大，一旦消毒不到位，就会导致类器官培养失败。类器官污染常见类型有细菌、真菌、支原体、黑胶虫等污染源，今天小爱带大家学习鉴别类器官污染及除菌方案。

二、类器官污染鉴别

1、细菌污染

细菌污染-肉眼下

污染特征：

● 肉眼下可明显观察基质内有明显黑色球体物；

● 而且呈多个黑色球状物分布；

● 生长迅速，通常D1就有会出现；

● 培养液隔夜即会变红黄浑浊。

细菌污染-镜下类器官原代提取D1

细菌污染特征：

● 细菌集落呈黑色团球状，wan全不透；

● 外围模糊，有朦胧感；

● 爆发非常快，一般1-2天即可出现大量集落。

细菌克星

2、真菌污染

左图 真菌污染特征——霉菌

右图 真菌污染特征——根霉

霉菌污染特征：

● 早期并不会使得培养基变黄变浑浊，但在显微镜下可观察到菌丝体；

● 真菌形成的菌丝呈丝状，管状，树枝状，串珠状。

真菌污染——酵母菌

小鼠胃类器官P0D1中发现的酵母菌团从左到右依次是4X、10X、20X

类器官基质胶中的酵母菌污染

类器官基质胶中的酵母菌+根霉污染

酵母菌污染特征：

● 酵母菌呈类似棉花絮状的团状物；

● 酵母菌等，当其行出芽生殖时可从一大一小的连体结构识别；

● 细胞被污染后，仍可生长，长时间类器官活力状态会变差；

● 梅雨季时的污染率会提高。

真菌克星

3、黑胶虫

黑胶虫污染特征：

● 活跃扭动；

● 多呈杆状；

● 培养基不浑浊。

黑胶虫清除剂PLUS (500×) abs9841

产品优势：

1）性能稳定：通过细菌、真菌、支原体、内毒素检测；通过渗透压、pH检测；通过产品性能检测；

2）高效快速：有效实现对“黑胶虫"的抑制和灭杀，减少不必要的实验损失；

3）环保安全：经上百种细胞验证无毒害作用。

使用方法：

1）请在收到货后， 将试剂管瞬时离心(3000rpm，3~5s)保存；

2）使用黑胶虫清除剂处理时， 建议现配现用， 并保持细胞密度在50%~60%；

3）推荐稀释比例为1:500。例如5mL培养基中加入10μL的黑胶虫清除剂。丢弃旧的培养基， 用PBS将细胞清洗干净， 再加入含有黑胶虫清除剂的新鲜培养基， 2天一次，连续处理一周。

黑胶虫预防剂（1000×）abs9842

产品优势：

1）高效稳定：通过产品性能检测，能够有效防治细胞培养中的“黑胶虫"污染问题；

2）环保安全：对细胞无毒性作用，在细胞培养过程中不会对细胞造成影响，本产品为多肽类，不像抗生素会影响细胞生长状态并让细胞产生耐药性。

使用方法：

1）使用黑胶虫预防剂(1000X)时， 建议现配现用；

2）推荐黑胶虫预防剂(1000X)的稀释比例为1:1000, 例如：10mL的培养基加入10μL的黑胶虫预防剂(1000X)。

4、支原体污染

支原体是实验室中常见的污染细胞的原核生物，污染主要来自组织、血清等动物性原材料和操作者本身。支原体直径在0.1-0.3μm，显微镜下也很难分辨，一般通过吸取培养液上清采用qPCR技术扩增DNA检测。

1）检测原理

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团（报告基团），如FAM、CY5、VIC等，3’端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ1等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针，探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统（荧光定量PCR仪）可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成wan全同步。本试剂盒采用多重PCR的方法，用2种不同的荧光探针分别检测目标序列与内参。

2）清除试剂

支原体清除试剂Plus abs9253

产品优势：

● 特异性清除培养基中的支原体；

● 只需要3-6天，便可以有效清除支原体；

● 活性成分为抗生素，不会产生耐药性；

● 对细胞几乎无毒性，在100多种细胞上进行过验证，包括但不限于HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等；

● 广谱性，可替代双抗，可以清除常见的革兰氏阴性和阳性菌；

● 可直接加入血清、培养基中，用于清除支原体污染。

3）使用方法

A、储存液的配制： 

称取适量支原体清除试剂，配制成10mg/mL的储存液。适当分装后-20℃保存。如长时间不使用，也可以-80℃保存；

B、预防支原体污染或抑制支原体：

在细胞培养液中加入适量支原体清除试剂储存液，使最终浓度为0.01-0.5μg/mL，通常推荐使用的浓度为0.2μg/mL或0.5μg/mL。在添加了前述剂量的支原体清除试剂的情况下，可以有效防止支原体污染或抑制支原体增殖；

C、清除污染的支原体：

对于发现或怀疑有支原体污染的细胞，在细胞培养液中加入适量支原体清除试剂储存液，使最终浓度为0.5-250μg/mL。推荐依次尝试使用25、50、100和250μg/mL这4个浓度。在添加了前述剂量的支原体去除试剂的细胞培养液中培养1周后，检测是否还存在支原体污染。如果还是存在支原体污染，可以酌情提高支原体清除试剂的工作浓度。

5、非污染情况

因为类器官原代培养中，会有很多杂质、组织碎片、成纤维细胞等，容易造成细胞“污染"的假象，其实并非污染，如下所示：

1）成纤维细胞

成纤维细胞的胞体细长，又呈纤维样，很容易被误认为是菌丝体，被误判成真菌污染。其实仔细观察，成纤维细胞成梭形，胞体中间粗，两头细长，而菌丝体整体粗细均匀。

左图 基质胶底层贴壁生长的成纤维细胞

右图 真菌污染特征——霉菌

2）组织碎片

在提取原代细胞的过程中，在组织解离过程中产生很多细胞碎片及杂质，故原代培养背景会比较脏，这种情况也容易被误认为污染。接下来，小爱带大家了解一下组织碎片特点：

● 原代组织碎片往往成不规则形状，区别于菌团椭圆形菌落形态；

● 原代组织杂质往往大小不一，形态各异；菌团形态均一，均为椭圆状。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎一起交流哦！

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