在当今生物医学研究领域，精准、高效地识别和追踪目标分子是解锁疾病机制、开发新型药物以及推动个性化医疗的关键。抗体/蛋白标记技术作为一种强大的工具，在这一过程中发挥着不可替代的作用。通过将特定的化学标签（如荧光染料、酶或放射性同位素）与抗体或蛋白质共价结合，研究人员能够以更高的灵敏度和特异性对复杂生物系统中的目标分子进行可视化和定量分析。

常见抗体/蛋白标记技术

荧光素标记：使用荧光素如Alexa Fluor系列（AF488\AF594\AF647等）、Cy系列（Cy3\Cy5\Cy7等）、FITC等与抗体或蛋白结合，常用于流式细胞术、免疫荧光和活体成像等实验；

酶标记：如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)标记，通过催化底物生成有色产物或化学发光，用于ELISA、Western Blot、免疫组化等实验；

生物素标记：生物素(Biotin)标记法是利用生物素与抗体或蛋白等生物大分子的氨基结合，广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究。

一、Alexa Fluor系列染料概述

Alexa Fluor染料是罗丹明等染料的衍生物，利用磺酸或磺酸盐代替罗丹明等染料中的氢原子合成。主要应用于生物研究中对组织、细胞和生物分子的标记和定位。标记抗体和蛋白的Alexa Fluor系列染料其发射光谱、激发光谱、常用的激发光和等效染料如表1所示。其中较常用的是绿色荧光探针Alexa Fluor 488。与绝大部分常用的绿色荧光探针相比，Alexa Fluor 488更加明亮，不容易荧光猝灭，背景更低。

表1 常用标记抗体/蛋白的Alexa Fluor系列染料

抗体/蛋白Alexa Fluor标记原理及优势

Alexa Fluor标记利用了高效和简单的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯化学反应，选择性地将Alexa Fluor染料与邻近蛋白质的氨基基团（-NH₂，包括赖氨酸侧链和氨基端）相连接，共价结合形成一个稳定的琥珀酰亚胺酯结构（图1）。

图1 NHS酯反应示意图

R表示具有NHS酯反应基团的标记试剂或交联剂的一端；P表示含有伯胺(-NH₂)的蛋白分子

Alexa Fluor系列染料具有以下优势：

①发射光谱窄。相较于传统有机荧光染料，Alexa Fluor染料具有较窄的发射光谱，从而降低不同检测的交叉水平；

②荧光强度强，光稳定性好；

③受温度和pH的影响较小；

④具有良好的水溶性。无需有机试剂Alexa Fluor染料即可结合蛋白质，且储存不易产生沉淀；

⑤Alexa Fluor系列染料具有不同的颜色，可根据实验需要，用不同Alexa Fluor染料标记不同的对象，从而实现区分。

二、Cy系列染料概述

Cy是花菁(Cyanine)的缩写，也叫菁染料。Cy染料性能优良，摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的。通常情况下，根据需要标记的生物分子可标记基团（如胺基、醛基或巯基）以及酸碱性，选择相应的活化（NHS酯、羧酸基团、异硫氰酸酯、马来酰亚胺等）染料和反应条件 。其NHS酯是较常用的脂肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。其中菁染料Cy3和Cy5 已成为基因芯片的选择荧光标记物；另外，Cy5、Cy5.5和Cy7的吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度最高、且稳定的长波长染料，特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素（图2）。

图2 Cy3(左)，Cy5(中)和Cy7(右)染料的最大吸光度(虚线)和发射光(阴影区域)

Cy系列染料的优点：

①光谱窄，信号强，灵敏度高；

②染料的摩尔吸光系数高于其他荧光染料；

③染料细胞毒性小，可用于标记抗体、蛋白、细胞；

④荧光波段在近红外区段的组织透过性好，非常适合做小鼠活体成像。

三、HRP和ALP标记概述

辣根过氧化物酶（HRP, Horseradish Peroxidase）和碱性磷酸酶（ALP, Alkaline Phosphatase）是两种常用的酶标记，它们可以与抗体结合，用于各种免疫学检测方法中，如ELISA、Western blotting、免疫组化等。这些酶标记的抗体能够通过特定的底物反应产生可检测的信号，从而帮助定量或定位目标抗原。

辣根过氧化物酶（HRP）特点：HRP是一种非常稳定的酶，在广泛的pH范围内都能保持活性。它催化过氧化氢（H₂O₂）与某些供氢体之间的反应，生成有色产物或发光信号。

应用：

①ELISA：在酶联免疫吸附测定中，HRP标记的二抗可以用来检测被固定在板上的抗原-一抗复合物。

②Western Blotting：HRP标记的抗体可用于识别并显色转印到膜上的蛋白质条带。

③免疫组化：HRP标记抗体用于组织切片中的抗原定位，通过染色来观察细胞内的特定分子。

碱性磷酸酶（ALP）特点：ALP在碱性条件下较活跃，它能去除磷酸根基团，将无色的磷酸酯底物转化为有颜色的产物。相比于HRP，ALP可能对一些底物显示出更高的特异性和稳定性。在某些情况下，ALP产生的信号比HRP更持久，这有助于提高低丰度抗原的检测能力。

应用：

①ELISA：类似于HRP的应用，但通常使用不同的底物。

②免疫组化：ALP特别适合用于需要长时间染色或保存染色结果的情况。

③原位杂交：ALP也常用于核酸探针的标记，以便在细胞内定位DNA或RNA。

四、生物素标记概述

生物素（Biotin）是一种小分子维生素，也称为维生素H或B7。经活化后（Biotin-NHS）可与蛋白/抗体等生物大分子的氨基结合，不仅可以很好地保持大分子的生物活性，而且与亲和素结合使用时具有多级放大作用，使其广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究。

在进行生物素标记时，需要注意几个关键点：

① 待标记物的浓度不应过低，以确保标记效率；

② 生物素与待标记物的比例要合适，以避免影响待标记物的活性；

③ 为了减少空间位阻的影响，可以在生物素与被标记物之间加入交联臂结构；

④标记反应后的纯化步骤至关重要，以去除未反应的生物素和其它杂质。

常见问题解答

Q1：蛋白标记FITC损耗怎么样？

A1：损失比较小，有95%以上的收率。

Q2：AF488标记抗体的原理？

A2：基于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的化学反应，该反应可以与抗体分子中的伯胺基团(-NH2)形成稳定的酰胺键，之后脱盐柱去除游离的染料。

Q3：流式实验，抗体标记推荐什么染料合适？

A3：流式实验需要纯化，不建议PE（收率只有20%左右）和APC标记（收率50%左右）可以推荐小分子荧光标记，如FITC、AF系列，Cy系列等，标记效率很高，可以满足流式实验。

Q4：抗体中含有50%的甘油，可以标记吗？

A4：可以，我们会先进行透析，去除甘油后再进行标记。

Q5：生物素标记蛋白，有标记效率及COA吗？

A5：95%以上的标记效率，呈正态分布，蛋白和生物素1:3，按照标准流程标记。COA有的，COA里包含浓度，体积和buffer信息。

Q6：标记的抗体/蛋白如何保存？

A6：无论是荧光染料偶联抗体、酶偶联抗体还是生物素偶联抗体，都需要保存在深色瓶内，或者包裹上铝箔纸。收到产品后立即分装，避免反复冻融。不要在HRP偶联抗体中加入叠氮hua钠，因为这种保护剂会抑制HRP的活性。短期储存放在4℃（1-2周），如果需要长期储存，应加入冷冻保护剂（如甘油）后置于-20℃下保存。

Absin可以提供多种常见荧光素FITC\AF488\AF594\AF647/CY3/CY5/ CY5.5/CY7以及HRP或者生物素的标记，体系成熟，目前常规染料标记周期1-2周。

此外，我司还可提供产品定制和实验服务，包括定制抗体、定制多肽、定制蛋白、定制mRNA、定制肿瘤/传染病抗原特异性T细胞含量检测刺激物、多重荧光免疫组化服务、ELISA服务、生化检测服务、TR-FRET服务、标记、纯化等服务。更多定制需求请联系我们。

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