一、免疫荧光的原理

免疫荧光(Immunofluorescence，IF)技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

二、IF分类

三、IF实验流程

1）样品准备：对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤 (1000rpm、5min) 2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片；

2）固定：4%多聚甲醛(PFA)溶液固定细胞15min，PBS洗涤3遍，每次5min；

3）通透：0.5% TritonX100，通透15-20min，PBS洗涤3遍，每次5min；

4）封闭：3%牛血清蛋白(BSA)室温封闭30min-1h ，封闭的作用是可以减少一抗和二抗与非靶标位点进行非特异性结合时所产生的本底信号；

5）抗孵育：封闭过后，不用洗，直接将多余的BSA吸走，用稀释后的一抗（用3% BSA稀释）4度过夜孵育;

6）二抗孵育：PBST洗涤3遍，每次5min，洗去未结合的抗体。而后用稀释后的二抗（用3% BSA稀释）室温避光孵育1h，PBST洗涤3遍，每次5min；

7）细胞核染色：滴加DAPI避光染色5min，PBS洗涤3遍，每次5min（染细胞核是为了定位细胞）；

8）拍照：立即用激光共聚焦或荧光显微镜进行拍照，如果需要等待，则避光放在4°保存。

四、检测方法

检测方法分为直接检验和间接检验，我们一般多采用间接检验（一抗+二抗）的方式。

五、免疫荧光双染

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色双重免应焚光标记法也分为直接法和间接法。

1）直接法：将两种不同荧光素偶联的抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，样本孵育，润洗，封片，镜检；

特点：简便可靠，不需要考虑一抗种属来源的问题，但灵敏度较低。

2）间接法：用未标记的两种一抗薄育样本，润洗后，加入两种不同的荧光素偶联的对应二抗辩育样本，润洗，封片，镜检；

3）特点：使用此法应注意两种特异性一抗必须来源于不同种属，且荧光标记二抗、一抗的种属要相匹配。

六、IF注意事项

1）固定时间影响荧光固定效果，针对细胞样品，如果用4%多聚甲醛固定，推荐固定时长15min，时间太短没有达到固定效果时间太长会导致甲醛被氧化成甲酸，没有固定作用了；

2）保持醛固定液新鲜，否则自发荧光背景会升高；

3）使用抗体时，需要查询说明书。因为不同抗体使用场景不一样，确认抗体是否能用于细胞IF、冰冻切片IF、 石蜡切片IF；

4）细胞密度是整个实验能否成功的关键点之一。如果细胞数量太多，产生叠加，也会影响整体荧光效果；

5）洗涤过程轻柔，防止加液过程冲力过大丢失细胞；

6）通透时间一般为15-20min，过短过长效果均不好，应做不同时间梯度摸索。

七、IF常见问题总结

1）信号微弱或没有信号

2）高背景

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