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- IHC Trouble Shooting
- 点击次数:1865 更新时间:2018-03-26
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问题一:缺乏染色 可能的原因 检测方法和相应的措施 没有抗原 用原位杂交的方法检测蛋白表达(有时即使能检测到mRNA。翻译也有可能受阻) 由于错误的储存方法 按照说明书储存。通常,将抗体按照足够配制单次实验工作溶液的体积分装。储存在手动除霜冰箱中(-20到-70℃),避免反复冻融 无效的一抗或二抗 单独检查报告系统以评估试剂的有效性。 固定不充分 尝试增加固定时间或改用不同的固定剂 过度固定 减少浸润或固定后步骤的时间。如果必须使用浸润法固定(例如病理实验室中的尸检组织或切片),可以用抗原修复试剂修复被遮蔽的表位 不兼容的二抗和一抗 使用可以与一抗结合的二抗。例如,如果一抗是兔源的,则使用抗兔的二抗 在与一抗孵育前抗原被破坏 如果内源性过氧化物酶的封闭是在加入一抗前进行的,则改为加入一抗之后在封闭 在固定或包埋过程中表位发生改变 尝试使用不同的抗原修复技术修复免疫反应性。在58℃以下包埋组织。 抗原修复无效 增加修复时间或更换修复液 漏用试剂或未按正确的顺序加入试剂 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序正确 问题二:高背景 可能的原因 检测方法和相应的措施 一抗或二抗的浓度过高 对抗体进行滴定以确定获得特异性反应的*浓度 抗体和组织中蛋白的疏水相互作用 降低抗体稀释液的离子强度(降低盐浓度对单克隆抗体尤其有效) 一抗和/或二级试剂与组织的非特异性结合 一抗孵育前进行封闭(我们用1%的牛血清蛋白或者10%的正常驴血清,也可以使用脱脂奶粉) 二抗的非特异性结合 使用去除了交叉反应性IgG的抗体(针对样品目标种属去除) 组织过于干燥 在染色过程中避免组织干燥 试剂粘附在旧的或未制备好的玻片上 用新鲜制备或购买的玻片进行实验 由于离子相互作用造成的背景 增加稀释缓冲液的离子强度 问题三:细胞/组织的形态被破坏 可能的原因 检测方法和相应措施 抗原修复方法过于激烈 在抗原修复的时候根据经验确定合适的条件以保持组织形态 组织切片从玻片上脱落(更常见于冰冻切片) 增加固定时间。根据经验增加额外的或更换固定剂。使用新鲜准备的,带有充足电荷的玻片 组织切片撕裂或皱褶。切片下有气泡 使用锋利的刀片重新切片或者在分析结果的时候忽略受损的区域 组织形态难以分辨 切片的时候切得薄些。冰晶有可能破坏冰冻切片的形态 固定不充分的组织或细胞在染色时可能遭到破坏 增加固定时间和/或进行二次固定。提高固定剂/组织的比例。将组织切的较小以获得更*的浸润固定 组织的自发裂解产生很多染色的坏死碎片 增加固定时间,比率。考虑使用交联性固定剂 问题四:染色不正确 可能的原因 检测方法和相应的措施 固定方法对于抗原不合适 尝试不同的固定剂或增加固定时间 抗原修复方法对于抗原或组织可能不合适 尝试改变抗原修复条件 抗原的静电荷发生了改变 尝试调整抗体稀释液的pH值或阳离子浓度 没有及时固定引起抗原的扩散 立即固定组织。尝试用交联性固定剂替换有机(醇类)固定剂