IP trouble shooting

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问题一：高背景
可能的原因	解决方法
去污剂不溶性蛋白有残留	离心后立即去除上清，沉淀中留有不溶性蛋白质，如果再次有悬浮发生，再次离心
洗涤不充分	盖上管盖离心前反复颠倒几次
非特异性蛋白质与珠子结合	珠子用BSA预封闭不充分，确保牛血清白蛋白（组分V）新鲜，新鲜珠子与含1%牛血清白蛋白的PBS孵育1小时，使用前PBS洗3-4次
使用的抗体特异性不强	使用亲和纯化的抗体，预先吸收
使用太多抗体导致非特异性结合	检查推荐抗体用量。尝试使用更少的抗体
细胞裂解液中含有太多的细胞或太多蛋白，导致洗脱液中很多额外的（假阳性）蛋白质	减少细胞数量/裂解液使用。我们推荐使用10-500ug细胞裂解液
蛋白与抗体非特异性结合	如果有很多非特异性结合的蛋白质，可以尝试较少上样珠子的样本数量。您还可以在开始免疫沉淀实验之前预先孵育珠子和准备好的裂解液来预清除裂解液。应该清除裂解液内任何与珠子非特异性结合的蛋白，一些研究人员也使用同种来源和相同免疫球蛋白亚类的无关抗体来预清除裂解液
免疫沉淀实验时抗原降解	确保样品裂解时加入新鲜的蛋白酶抑制剂

问题二：大量抗体被洗脱
可能的原因	解决方法
太多抗体与目的蛋白被洗脱	尝试减少抗体用量。免疫沉淀前将抗体与珠子交联，并使用温和的甘氨酸缓冲液梯度洗脱将大大减少抗体洗脱量

问题三：没有检测到目的蛋白洗脱
可能的原因	解决方法
所用样品中不表达或低水平表达目标蛋白	检查目标蛋白质的表达谱，以确保他会在您样品的细胞表达。如果有目标蛋白低水平表达，增加裂解液的使用量。但是，这可能导致增加非特异性结合，所以开始免疫沉淀程序之前预先清除裂解液
没有足够的抗体捕获目标蛋白	检查抗体的建议使用量。抗体浓度可能需要增加
目标蛋白没有从珠子上洗脱	确保您使用的洗脱缓冲液是正确的，并且是洗脱蛋白质所需的正确强度和pH值
抗体没有结合免疫吸附磁珠	确保您使用的珠子与抗体亚型匹配
使用的裂解液不正确	检查说明书，看看抗体是否能检测变性蛋白质或天然蛋白质，并确保使用正确的裂解液